张钧杰，杨洁，张青，李金磊，吴宁鹏，吴志明*

(1.河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002; 2. 河南省兽药饲料监察所，郑州 450008)

大肠杆菌是人和动物肠道内的共生菌，在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道、尿道等多种局部组织器官感染。猪大肠杆菌病是由致病性大肠埃希氏菌引起的一种常见、多发的仔猪传染病，其发病率和死亡率均居仔猪疫病之首，给养猪业带来了巨大的经济损失。而且其血清型众多、临床症状和病理变化复杂，疫苗防治效果较差，临床上常用抗菌药物治疗，但由于抗菌药物的不合理使用，导致大肠杆菌产生耐药性或超级细菌[1-3]。而耐药菌会随畜禽粪便排出，对环境中的土著细菌产生影响[4-5]，也会造成多重耐药[6-7]。为掌握河南省猪源大肠杆菌的耐药情况，本研究于2013年至2018年间对河南省郑州、开封、焦作、许昌4个地区部分规模化养猪场分离出的856株大肠杆菌，经过对8类13种抗菌药物的耐药性调查，分析比较不同年份间和不同地区间猪源大肠杆菌的耐药情况及其流行规律，以期为指导兽医临床科学用药和保障畜产品安全提供可持续发展思路。

1 材料与方法

1.1 菌株 所有样本均采用肛门拭子法采集，经分离纯化和常规鉴定后得到，郑州、开封、焦作、许昌分别为190株、154株、287株、225株，共计856株；质控菌株大肠杆菌ATCC25922购自中国兽医药品监察所。

1.2 试剂 一次性无菌采样棒(BPW)，购自郑州君越公司；麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、营养琼脂，购自北京路桥技术有限公司；革兰氏阴性细菌鉴定板，购自BD公司；革兰氏阴性细菌药敏试剂盒，购自上海星佰生物技术有限公司。

1.3 主要仪器设备 低温可叠放摇床(MaxQSHKE6000-8CE)，购自Thermo公司；细菌浊度仪，购自北京中西远大科技公司；全自动细菌鉴定/药敏系统(BD PhoenixTM-100)，购自BD公司；高压灭菌锅，购自上海三申医疗器械有限公司；电子天平，购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

1.4 大肠杆菌的分离与鉴定 使用一次性无菌采样棒，采取猪的肛门分泌物，然后在恒温培养箱中(36±1) ℃条件下培养16～20 h，同时设阳性对照和阴性对照，然后用一次性无菌塑料接种环取预增液1～2环，于麦康凯琼脂平板上培养，恒温培养箱中(36±1) ℃条件下培养16～20 h，再选取单个典型可疑菌落在麦康凯琼脂上划线进行纯化，最后将纯化好的菌落划线接种于营养琼脂培养基，挑取单个菌落用全自动细菌/药敏鉴定系统进行鉴定。

1.5 药敏实验 取经鉴定的大肠杆菌，用生理盐水调制0.5麦氏浓度后，然后再用试剂盒中的肉汤进行100倍稀释，混匀备用。除空白对照外，其余的95孔加入制备好的菌液100 μL，空白对照孔中加入100 μL无菌肉汤，将96孔药敏实验检测板放置恒温培养箱中孵育，读取药敏试验结果。

2 结果与分析

2.1 分离鉴定结果 2013年至2018年，经分离鉴定，共获得856株大肠杆菌，分离率为80.0%。结果见表1。

表1 2013～2018年猪源大肠杆菌分离鉴定结果Tab 1 Results of isolation and identification of Escherichia coli from swine in 2013～2018

2.2 不同地区大肠杆菌的耐药情况 从表2可以看出，从河南省四个地区分离的猪源大肠杆菌对13种药物的耐药率范围分别为：郑州10.3%～88.4%、开封22.4%～93.8%、焦作11.8%～96.4%、许昌21.1%～98.2%。分离菌耐药率在35.0%以下的药物有6种，分别是氧氟沙星、恩诺沙星、黏菌素、庆大霉素、头孢噻呋和阿莫西林/棒酸，其中郑州有5种，焦作有6种，开封和许昌皆为3种；耐药率在90.0%以上的药物有5种，分别是四环素、多西环素、氟苯尼考、磺胺异恶唑和氨苄西林，其中许昌有5种，开封和焦作皆为3种，郑州为0。郑州、开封地区分离菌对头孢噻呋平均耐药率最低分别为10.3%和22.4%，对四环素平均耐药率最高分别为88.4%和93.8%；焦作地区分离菌对黏菌素平均耐药率最低为11.8%，对四环素平均耐药率最高为96.4%；许昌地区分离菌对阿莫西林/棒酸平均耐药率最低为21.1%，对四环素平均耐药率最高为98.2%。郑州、焦作地区分离菌对氧氟沙星、恩诺沙星、黏菌素、大观霉素、头孢噻呋和氨苄西林的耐药率水平相当，但均低于开封和许昌地区；焦作地区分离菌对氧氟沙星和庆大霉素的耐药率低于其他三个地区。

表2 2013～2018年四个地区分离856株猪源大肠杆菌对13种抗菌药物耐药性结果Table 2 Results of the isolation of 856 strains of E.coli Isolated from pigs to 13 antimicrobial agents in four regions from 2013 to 2018

2.3 不同年份大肠杆菌的耐药情况 结果见表3。2013～2018年猪源大肠杆菌的耐药率范围为56.6%～63.8%。2013～2018年分离菌耐药率在35.0%以下的药物有6种，分别是氧氟沙星、恩诺沙星、黏菌素、庆大霉素、头孢噻呋和阿莫西林/棒酸，其中2013年和2014年皆为4种，2015年有3种，2016年有6种，2017年和2018年皆为5种。分离菌耐药率在90.0%以上的药物有6 种，分别是四环素、多西环素、氟苯尼考、磺胺异恶唑、复方新诺明和氨苄西林，其中2013年和2014年皆为2种，2015年和2016年皆为3种，2017年有1种，2018年有5种。2013年和2014年分离菌均对头孢噻呋耐药率最低，分别为3.6%和4.1%，均对四环素耐药率最高，分别为94.4%和94.2%；2015年分离菌对阿莫西林/棒酸耐药率最低为2.3%，对氟苯尼考耐药率最高为93.8%；2016年分离菌对阿莫西林/棒酸耐药率最低为5.9%，对氟苯尼考和四环素耐药率最高为97.6%；2017年分离菌对粘菌素耐药率最低为5.6%，对四环素耐药率最高为94.4%；2018年分离菌对粘菌素耐药率最低为0.0%，对多西环素耐药率最高为100.0%。对黏菌素的耐药率在2013年至2015年持续升高达到55.0%后，开始大幅下降，在2018年降为0.0%；对四环素的耐药率连续6年皆在90.0%以上；对多西环素的耐药率整体保持较高水平，在2018年上升至100.0%。

表3 2013～2018年856株猪源大肠杆菌对13种抗菌药物药敏试验结果Tab 3 drug sensitivity test results of 856 strains of E.coli from pigs to13 antimicrobial agents in 2013～2018

2.4 猪源大肠杆菌多重耐药情况 2013年至2018年多重耐药主要集中在耐5、6和7类抗生素。2013年有91.8%的菌株耐3类及以上药物，其中耐5类抗生素的菌株最多，为35.7%；2014年有90.0%的菌株耐3类及以上药物，其中耐5类和7类抗生素的菌株最多，均为19.9%；2015年有94.6%的菌株耐3类及以上药物，其中耐7类抗生素的菌株最多，为27.1%；2016年有92.6%的菌株耐3类及以上药物，其中耐5类抗生素的菌株最多，为46.3%；2017年有94.5%的菌株耐3类及以上药物，其中耐6类抗生素的菌株最多，为28.9%；2018年100.0%的菌株耐3类及以上药物，其中耐5类抗生素的菌株最多，为43.0%。

从图1可以看出，耐0类抗生素的菌株比例为零；耐1类、2类和3类抗生素的菌株比例在11.1%以下；耐4类抗生素的菌株比例整体保持平缓趋势，维持在15.0%左右；耐5类抗生素的菌株变化起伏较大，但整体维持在30.0%左右；耐6类抗生素的菌株比例整体呈上升趋势；耐7类和8类抗生素的菌株比例整体呈下降趋势。

图1 2013～2018年856株猪源大肠杆菌对8类抗菌 药物的多重耐药情况Fig 1 Multidrug resistance of 856 strains of E.coli from swine to 8 kinds of antibiotics in 2013～2018

3 讨论与结论

结果表明，从河南省郑州、开封、焦作、许昌四个地区分离的猪源大肠杆菌，对13种药物耐药分布有些微差异，其中郑州和焦作地区分离菌对氧氟沙星、恩诺沙星、黏菌素、大观霉素、头孢噻呋和氨苄西林六种药物耐药率低于开封和许昌地区，焦作地区分离菌对氧氟沙星和庆大霉素耐药率显著低于其他三个地区，这种差异可能与各地区的药物使用习惯有关。

2013～2018年猪源大肠杆菌的平均耐药率整体保持平稳，无明显的年份差异。分离菌对氧氟沙星、恩诺沙星、四环素等12种抗菌药物的耐药率与吴宁鹏[8]在2014至2015年对焦作和许昌地区的研究结果基本一致，但对黏菌素的耐药率100.0%与本研究31.1%相差较大；对恩诺沙星、四环素和庆大霉素的耐药率与李杰[9]在2017年对南阳地区的研究结果基本一致；对磺胺异恶唑、复方新诺明和氨苄西林的耐药率大于80.0%，与艾伟昌在2017年对河南地区的研究结果吻合[10]；对氟苯尼考的耐药率从2013年的76.0%上升至2018年的90.0%，一直处于较高水平[11-12]，与其在临床上被广泛应用于治疗猪源大肠杆菌病有关；对头孢噻呋的耐药率与李进福在2015年对河南的郑州、开封、新乡等8个地区的研究结果一致[13]；黏菌素作为人类抵抗细菌耐药性的“最后一道防线”[14]，耐药率从2013年的32.1%升高至2015年的55.0%，在2018年降为0.0%，跟我国在2016年出台的农业部2428号公告禁止硫酸黏菌素用于动物促生长政策有关，与毛福超和张晗珺研究[15-16]相似，说明对抗菌药物监管政策的加强，可有效降低药物的耐药性。

在多重耐药方面，2013至2018年有大于90.0%的菌株对3类及以上药物耐药，其中耐5、6和7类抗生素的菌株比例最高，而耐6类抗生素的菌株比例整体呈上升趋势，从中可以看出我国猪源大肠杆菌的耐药性问题越来越严重。

本研究结果表明河南省部分养殖场中猪源大肠杆菌耐药形势严峻，且多重耐药现象严重，与其他作者对河南省研究结果相似。因此，建议应加强对大肠杆菌的耐药性监测，针对其结果合理使用抗菌药物。