徐海涛，高宁阳，顾新丰，张 琥，杜 炯，谈绎文，王学宗，郑昱新

上海中医药大学附属曙光医院骨关节科(上海 201203)

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种慢性退行性病变，多发生于中老年人群。在中医理论中，OA被归纳于“骨痹”“骨痿”范畴，其发病机制为气血不足，肝肾亏虚。人到中年，人体肝肾功能下降，供血不足，容易导致筋骨失养，湿寒侵入机体后容易造成筋脉痹阻不通[1-2]。还可由激素紊乱、肥胖、关节过度劳损和外力损伤等因素引发关节软骨退化和骨质增生，严重影响患者的正常运动功能及其生活质量[3-4]。因此，如何延缓及修复OA患者的关节软骨退化和骨质增生是目前骨关节病临床上的一大热点问题。Wnt/β-catenin信号通路是一个可参与调节细胞增殖和凋亡等多种生物进程的信号转导途径[5]。微小核糖核酸(Micro ribonucleic acid，miRNA)能够识别目标miRNA的3’非编码区的结合位点进行碱基配对，实现基因在转录后表达的负调控，从而能够参与大多数真核生物的细胞凋亡、增殖等功能[6-7]。miRNA-140作为miRNA家族中的一员，其在斑马鱼等动物中具有高度软骨特异性[8]。芍药舒筋片具有补益肝肾、散寒除湿、活血化瘀的功效，可用于治疗OA早中期肝肾亏损，血瘀经阻等症状的患者[9]。本研究通过构建OA大鼠模型，研究芍药舒筋片通过miRNA-140对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用，从而探讨芍药舒筋片对OA大鼠软骨细胞的保护作用机制。

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验动物：取SD大鼠45只，体质量(192.16±10.21)g。购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK(沪)2008-0016。复合饲料喂养，饲养温度为20 ℃～25 ℃，湿度为60%。将45只SD大鼠随机分为假手术组(15%正常大鼠血清+F12培养基)、OA对照组(15%正常大鼠血清+F12培养基+IL-1β)、OA治疗组(15%芍药舒筋片含药血清+F12培养基+IL-1β)，每组各15只。

1.2 实验药物：芍药舒筋片(真空干燥粉)，由上海中医大源创科技有限公司提供，批号：20110616。主要成分：白芍、秦艽、牡蛎、全蝎、蜈蚣、甘草。剂型：片剂；规格：0.35 g/片。

2 实验方法

2.1 骨关节炎软骨细胞造模方法：OA对照组和OA治疗组采用改良Hulth造模法[10]，即将大鼠麻醉固定于手术台上，无菌条件下去膝关节内侧纵切口长约2 cm，显露膝关节，切断大鼠膝关节前交叉韧带、内侧副韧带并缝合，保留关节软骨面。假手术组暴露关节腔而不切断前交叉韧带和内侧副韧带。三组均继续饲养，任其自由活动，可适当给予抗生素预防感染。假手术组和OA对照组在建模2周后开始灌胃生理盐水，OA治疗组则灌胃等量芍药舒筋片，1次/d，给药持续4周。

2.2 观察指标:培养4周后，连续8 d采用CCK-8溶液检测药物对细胞增殖的影响，用酶联免疫检测仪在波长450 nm处测量各孔的吸光值(OD)。软骨组织学评分采用Mankin[11]评分。

培养4周后，采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qTR-PCR)检测各组软骨细胞miRNA-140表达；采用qTR-PCR检测各组软骨细胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β miRNA表达：参照文献[12]，引物设计：Wnt-3a上游引物：5’-AGACTATCTCTGTCATG-3’，下游引物：5’-GCCCCGTATAGGCATTCGA-3’；β-catenin上游引物：5’-ACCATTCGGCTAAACGGTC-3’，下游引物：5’-CAGGCCATTTACGATTACA-3’；GSK-3β上游引物：5’-GCTATGAATTCGATCGAGT-3’，下游引物：5’-CAGGGCTTAGGCAGTGAA-3’。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60℃复性30 s，73 ℃延伸50 s，共循环32次，72 ℃、10 min。培养4周后，采用免疫印迹法(Western blot)[13]检测各组软骨细胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β蛋白表达。抽取细胞总蛋白，采用BCA方法鉴定蛋白浓度。

结 果

1 各组软骨细胞增殖比较 OA对照组中软骨细胞的增殖速率明显低于假手术组，相比较差异具有统计学意义(P<0.05)。OA治疗组中软骨细胞的增值速率明显高于OA对照组，相比较差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组软骨细胞增殖的OD值比较

2 各组关节软骨组织学评分及miRNA-140的表达比较 OA对照组中Mankin评分明显高于假手术组，miRNA-140相对表达量明显低于假手术组，且差异均具有意义(P<0.05)。OA治疗组中Mankin评分明显低于OA对照组，miRNA-140相对表达量明显高于OA对照组，相比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组关节软骨组织学评分及miRNA-140的表达比较

3 各组软骨细胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β miRNA表达比较 OA对照组和OA治疗组中细胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β miRNA表达水平明显高于假手术组，相比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。OA治疗组中细胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β miRNA表达水平明显低于OA对照组，相比较差异均具有意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组软骨细胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β miRNA表达比较

4 各组软骨细胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β蛋白表达比较 见表4(图1)。OA对照组和OA治疗组中细胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β 蛋白表达水平明显高于假手术组，相比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。OA治疗组中细胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β 蛋白表达水平明显低于OA对照组，相比较差异均具有意义(P<0.05)。

表4 各组软骨细胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β 蛋白表达比较

注：GAPDH是蛋白质表达检测内参

讨 论

OA是一种退行性慢性关节疾病，在我国传统医学中属于“痹症”“骨痹”范畴。《素问·气穴论》：“积寒留舍，荣卫不居，卷肉缩筋，肋肘不得伸，内为骨痹”指出骨痹与年老体衰、外感风寒湿有关。年老肝肾亏损，经骨失养，血瘀气滞，风寒湿邪，经络受阻[14]。因此，目前主要以补益肝肾、活血化瘀的药物治疗OA[15]。芍药舒筋片主要由白芍、秦艽、牡蛎、全蝎、蜈蚣、甘草等构成[16]。白芍养血柔肝，调经止痛；秦艽祛湿止痹，清热止痛；牡蛎滋阴壮阳；全蝎、蜈蚣通络攻毒，镇痉散结；甘草清热解毒，诸药合用，补益肝肾、散寒除湿、活血化瘀，对OA患者早中期肝肾亏损，血瘀经阻等症状有较好的治疗效果[17]。

本研究结果显示，与假手术组相比，OA对照组IL-1β诱导退化的软骨细胞增值速率明显降低，而OA治疗组中软骨细胞增值速率又明显高于OA对照组。说明芍药舒筋片治疗能够促进退化软骨细胞增殖。且研究结果显示，OA对照组中Mankin评分明显高于假手术组，OA治疗组中Mankin评分明显低于OA对照组。说明芍药舒筋片治疗后能够有效降低Mankin评分，延缓骨关节炎大鼠的软骨退变，对骨关节软骨起到一定的保护作用。钱春美等[18]研究发现，芍药舒筋片在高、中、低剂量下有较好的关节软骨保护作用，可降低Mankin评分，一定程度延缓机械失稳造成的膝骨关节炎大鼠的软骨退变，这与本研究结果部分一致。OA对照组中miRNA-140相对表达量明显低于假手术组，OA治疗组中miRNA-140相对表达量明显高于OA对照组。分析其中原因之一为IL-1β能够诱导软骨细胞退化，且能够抑制关节软骨细胞中miRNA-140的表达，而芍药舒筋片能够调节IL-1β诱导的软骨细胞退化程度。所以在经过IL-1β处理后的OA对照组中miRNA-140表达量明显降低，服用芍药舒筋片后的OA治疗组miRNA-140表达量高于OA对照组[19-20]。

本研究结果显示，OA对照组和OA治疗组中细胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β 的miRNA和蛋白表达水平明显高于假手术组，OA治疗组中的细胞Wnt-3a、

β-catenin、GSK-3β 的miRNA和蛋白表达水平明显低于OA对照组。说明芍药舒筋片能够降低Wnt/β-catenin信号通路活性，抑制其重要分子的miRNA和蛋白表达水平，从而延缓软骨细胞的退变速率。分析其中原因之一为在软骨细胞未分化时，Wnt-3a能够明显抑制miRNA-140的表达。因此，OA治疗组中表达较高的miRNA-140能够负调控Wnt-3a的表达水平，从而降低Wnt/β-catenin信号通路活性[21-22]。

综上，芍药舒筋片能够增加OA大鼠软骨细胞中miRNA-140的相对表达量和软骨细胞的增殖速率，降低Mankin评分，且能够通过调节Wnt/β-catenin信号通路活性，延缓软骨退变的作用机制，从而发挥其对关节软骨细胞的保护作用。