杨婧 屈晓一 党丹

脓毒症是因机体对感染反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍，且可在感染后持续进展，并最终导致促炎反应与抗炎反应的机制失衡、细胞凋亡和组织器官损伤等[1]。肺组织对于脓毒症性损伤十分敏感，文献报道大约有50%的脓毒症患者会出现脓毒症性急性肺损伤(sepsis induced acute lung injury, SI-ALI)[2]。脓毒症后炎症反应是引起肺损伤的主要因素，研究发现肺内皮细胞(endothelial cells, ECs)是炎症反应损伤的主要靶细胞[3]。一方面，过度的炎症反应会引起ECs损伤和肺功能障碍；另一方面，ECs的再生修复能力在炎症反应后可以被激活并具有修复肺损伤的作用[3]。基于以上文献报道，抑制脓毒症后过度炎症反应可能具有促进ECs发挥再生修复能力，并进而改善SI-ALI后肺功能的潜能。新近的研究发现，间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)具有调控脓毒症后免疫炎症反应的功能[4-5]。然而，MSCs是否能够促进SI-ALI后ECs发挥再生修复能力尚不清楚。鉴于此，本研究通过动物实验初步探讨了MSCs对SI-ALI大鼠肺ECs再生能力的作用。

资料与方法

一、 实验动物

33只成年雄性SD大鼠(周龄：8～10周，体重：250～300g)由本单位实验动物中心提供。将这些大鼠饲养在本单位实验室，饲养环境：12小时一循环的昼夜节律，温度21.0±2°C，湿度50～55%，并给予提供足够的水和食物。其中3只大鼠用于获取骨髓MSCs；另外30只用于后续实验。采用随机数字表法将30只大鼠随机分为3组：对照组、SI-ALI组和SI-ALI+MSCs组，每组10只。本单位实验经伦理委员会批准开展此项研究，实验动物操作流程按照中国实验动物操作指南进行。

二、实验试剂

所用试剂包括：检测MSCs表面分子的流式抗体CD29、CD45和CD90 (Abcam, UK)；构建SI-ALI模型的LPS (Sigma，USA)；检测炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α 相对应mRNA表达水平的逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriotion-polymerase chain reaction, RT-PCR) TRIzol 试剂盒(Invitrogen，USA)；BrdU (Sigma, USA)；检测ECs再生能力的抗BrdU抗体(Abcam, UK)和抗VE钙黏素抗体(Abcam, UK)；流式细胞术(flow cytometry, FCM)所用胎牛血清、多聚甲醛、流式洗液等。

三、MSCs的分离、培养和鉴定

利用水合氯醛将大鼠麻醉后颈椎脱臼处死，暴露出双侧股骨和胫骨，祛除肌肉、肌腱、筋膜等软组织。切断股骨、胫骨两端的干骺端，然后放置于含有10%胎牛血清、10%马血清和1%青霉素/链霉素(Life Technologies, USA)的L-DMEM培养基中，利用注射器多次抽吸培养基以冲洗骨髓腔至到发白。收集所有冲洗液，在室温、1200 r/min条件下离心8 min，祛掉上清液，保留离心后沉淀物。将分离的细胞均匀接种至含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素(Life Technologies, USA)的L-DMEM培养瓶中，培养条件为37℃、5% CO2。待细胞生长至80%～90%纯度时，离心后祛掉上清液，用PBS冲洗，胰酶消化后离心。将细胞沉淀再加入含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素(Life Technologies, USA)的L-DMEM培养瓶中，按 1 ∶2 比例传代，每瓶细胞培养基体积为 5 mL。参照前述方法继续传代培养，取第 3 代细胞用于后续实验。获取第3代细胞后，利用FCM对其表面分子进行鉴定，具体方法参见下文“1.7 流式细胞术”。

四、构建SIC大鼠模型和不同组大鼠处理

将LPS在生理盐水中溶解稀释，以6mg/kg的剂量通过腹腔注射的方法构建SIC大鼠模型。对照组大鼠只接受同等体积的生理盐水腹腔注射。在SI-ALI+MSCs组，MSCs以106/mL的浓度在LPS注射后2小时之内经过尾静脉注射给大鼠，每只大鼠注射剂量为2mL。为了检测大鼠肺中ECs的再生能力，在处死大鼠前24小时，将BrdU以150mg/kg的浓度通过尾静脉注射入大鼠体内。

五、肺组织标本获取

在LPS腹腔注射后72小时，并完成BrdU、MSCs等尾静脉注射后将各组大鼠处死，分离出肺组织并在预冷生理盐水中清洗干净，分装后在-80℃条件下保存以备后续实验使用。

六、实时定量聚合酶链反应 (RT-PCR)

利用RT-PCR检测肺组织中炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α 相对应mRNA的表达水平。具体步骤如下：首先利用TRIzol试剂并参照说明书提取出肺组织中的总RNA，RNA的量是利用260/280比值来确定的。每一个标本取1ugRNA用来逆转录为cDNA，每1ulcDNA被用来做RT-PCR检测，做RT-PCR的内参为β-actin。具体的操作步骤参照各种试剂的说明书进行。PCR的反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性20s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环，72℃延伸7min。每份标本检测3次，最终取平均值作为最终结果。

七、流式细胞术

参照文献报道的方法，分离大鼠肺ECs，然后将ECs重悬于含有10%胎牛血清的流式洗液中，以制备ECs单细胞悬液。将检测ECs再生能力的抗BrdU抗体(Abcam, UK)和抗VE钙黏素抗体(Abcam, UK)参照试剂说明加入ECs单细胞悬液中。避光、室温孵育2小时，离心后祛掉上清；加入反应终止液，离心后再祛掉上清。而后再用PBS清洗3次，并重悬于含有10%胎牛血清的流式洗液中，在流式细胞仪(BD, USA)上进行检测。检测MSCs表面分子的方法参照前述方法进行，所用抗体为兔抗大鼠CD44、CD56和CD90(Abcam, UK)。

八、统计学分析

实验所得数据以平均值±标准差(M±SD)的形式表示, 利用SPSS 17.0 统计学软件进行统计分析。三组间数据的总体比较采用单因素方差分析(ANOVA)，四组间的两两比较采用LSD-t方法。P<0.05 代表差异有统计学意义。

结 果

一、分离出了大鼠骨髓来源的MSCs

参照前述实验方法，分离出了大鼠骨髓来源的MSCs，利用FCM对MSCs表面分子CD29、CD45和CD90进行了分析，结果提示：CD29、CD90高表达，而CD45低表达，符合MSCs表面分子的表达特征(见表1)。

表1 MSCs表面分子表达率(%)

二、MSCs处理降低了SI-ALI大鼠肺组织中炎症因子的表达水平

与对照组相比，SI-ALI组大鼠肺组织中炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α的表达水平升高。与SI-ALI组相比，SI-ALI+MSCs组大鼠肺组织中炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α的表达水平降低(见表2)。

表2 MSCs处理降低了SI-ALI大鼠肺组织中炎症因子的表达水平(相对表达量)。

三、MSCs处理提升了SI-ALI大鼠肺组织中ECs的再生能力

与对照组相比，SI-ALI组大鼠肺组织中ECs的再生能力提高。与SI-ALI组相比，SI-ALI+MSCs组大鼠肺组织中ECs的再生能力进一步提高(见表3)。

表3 MSCs处理提升了SI-ALI大鼠肺组织中ECs的再生能力。

四、MSCs处理提升了SI-ALI大鼠的存活率

与对照组相比，SI-ALI组大鼠存活率明显降低。与SI-ALI组相比，SI-ALI+MSCs组大鼠存活率明显提升(见表4)。

表4 MSCs处理提升了SI-ALI大鼠的存活率(%)

讨 论

本研究通过动物实验初步探讨了大鼠骨髓来源的MSCs对SI-ALI大鼠肺ECs再生能力的作用，结果发现：MSCs减轻了SI-ALI大鼠肺组织中炎症因子的表达水平、增强了ECs的再生能力，并提高了存活比率。鉴于MSCs具有调控脓毒症后免疫炎症反应的功能[4-5]，MSCs可能是减轻脓毒症后肺损伤、促进肺ECs发挥再生修复能力并进而降低SI-ALI患者死亡率的一种新方法。

目前的研究认为，脓毒症的自然病程包含两个主要过程：早期的促炎过程和后期的抑炎过程，巨噬细胞在脓毒症后炎症反应的发生发展过程中发挥重要作用[3]。巨噬细胞通过释放抑炎因子或促炎因子调控脓毒症的病理生理过程。促炎因子是造成脓毒症后、器官损伤的主要因素。其中，肺组织对于脓毒症性损伤十分敏感，文献报道有50%左右的脓毒症患者会出现SI-ALI[2]，且肺ECs是炎症反应损伤的主要靶细胞[3]。一方面，过度的炎症反应会引起ECs损伤和肺功能障碍；另一方面，ECs的再生修复能力在炎症反应后可以被激活并具有修复肺损伤的作用[3]。之前的研究已经发现，巨噬细胞释放的促炎因子减少后，ECs的再生能力得以增强，且肺泡细胞、肺新生血管的数量均增多[6,7]。鉴于以上文献报道，寻找可行措施抑制SI-ALI后炎症反应，可能是提升ECs再生修复能力并进而降低肺损伤程度的有效策略。

MSCs具有免疫调节、抑制炎症反应和缓解器官衰竭等诸多功能，这为探索利用MSCs治疗脓毒症提供了新思路。脓毒症发生后，感染损伤相关分子与相应识别受体相互结合，激活并促进炎症小体的组装，从而介导巨噬细胞释放炎症因子。炎症因子可以通过炎症小体与更多的免疫细胞结合，从而产生级联放大效应，并最终导致细胞死亡和气管损伤[8]。新近的研究发现，MSCs可以在动物模型上减轻脓毒症后炎症反应，并从而缓解器官损伤[9-10]。基于MSCs的功能和现有研究报道，本研究尝试了利用MSCs抑制SI-ALI后炎症反应并进而促进ECs发挥再生修复能力和降低肺损伤程度的可能性。结果发现，MSCs减轻了SI-ALI大鼠肺组织中炎症因子的表达水平、增强了ECs的再生能力，并提高了大鼠总体存活比率。虽然本研究初步观察了MSCs对于SI-ALI后炎症反应和ECs再生能力的调控作用，其内含的机制尚需要开展更多的研究进行探讨。

总之，本研究通过动物实验发现：MSCs减轻了SI-ALI大鼠肺组织中炎症因子的表达水平、增强了ECs的再生能力，并提高了存活比率。MSCs可能是减轻脓毒症后肺损伤、促进肺ECs发挥再生修复能力并进而降低SI-ALI患者死亡率的一种新策略。