马洁，葛武鹏，赵丽丽，郗梦露，崔秀秀,郝果，王雨馨

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌712100；2.西安百跃羊乳集团有限公司，西安710000；3.陕西省羊乳产品质量监督检验中心，陕西富平711700；4.陕西中检检测技术有限公司，西安710068）

0 引 言

分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A,sIgA）是外分泌液中的一种抗体，主要存在于乳汁和胃肠液等外分泌液中，是肠道黏膜免疫系统中主要的效应因子，它区别于血清型免疫球蛋白A（immunoglobulin A,IgA）而被命名为sIgA[1-2]。sIgA可阻止肠道内病原微生物黏附在黏膜表面，促进吞噬细胞的吞噬作用，保护黏膜不受微生物的侵袭[3-4]。当肠道中sIgA的含量减少时，会使肠道中产气荚膜梭菌增加，致使婴幼儿肠道免疫功能降低，肠道菌群失调[5]。研究发现，sIgA是婴儿出生后最早获得的免疫物质，保护初生婴幼儿免受病原微生物的感染，在维持婴儿肠道的微生物稳态和婴儿肠道免疫功能方面具有重要意义[6]。婴幼儿的免疫系统发育缓慢，自出生起的4-6月内，新生儿消化道和呼吸道等防御病原微生物的免疫力主要来源于母乳中的sIgA[7]。相关研究证明母乳中的sIgA含量与喂养小孩的患病有相关性，较高的sIgA含量可被认为是健康婴儿的生物标志物[8]。因此对母乳中sIgA含量的检测，分析母乳的质量尤为重要。出生6个月后，婴幼儿的sIgA可由自身肠粘膜固有层的浆细胞合成，但合成能力不及成人一半[6,9]。母乳喂养虽然是婴幼儿sIgA来源的重要保证，但受到社会、生理、心理、个人健康等因素的影响，我国纯母乳喂养率仍然很低。据中国发展研究基金会于2019年发布的《中国母乳喂养影响因素调查报告》显示，我国婴儿6个月内纯母乳喂养率仅为29.2%，这对婴幼儿免疫系统的形成与健康成长带来隐忧，因此，婴幼儿配方奶粉作为母乳替代品是千万母婴家庭的必然选择。但喂养婴幼儿配方奶粉是否能增加sIgA含量，改善婴儿肠道免疫健康，以及针对不同分娩方式、出生月龄的婴幼儿在喂养婴配奶粉后，肠道健康又会有怎么样的差异，目前还尚不清楚。

藉此，通过酶联免疫分析法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测样品中的sIgA的含量，本研究依据签署的道德协议，采用非损伤采样法采集1-4月龄纯母乳喂养婴儿的健康乳母乳汁和对应婴儿粪便，探究不同阶段纯母乳喂养婴儿，粪便和母乳（初乳、成熟乳）中sIgA含量变化关系，为预测新生儿感染性疾病的发生提供资料；采集不同月龄（0～6月龄、6～12月龄、12～36月龄），不同喂养方式（纯母乳、混合、婴配羊奶粉、婴配牛奶粉）以及不同分娩方式（顺产、剖宫产）下的健康婴幼儿粪便，通过进行差异分析，为婴幼儿科学喂养奶粉配方优化提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人分泌型免疫球蛋白A酶联免疫分析试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；氯化钾（分析纯）；氯化钠（分析纯）；磷酸二氢钾（分析纯）；磷酸氢二钠（优级纯）。

ME303E型精密电子天平（0.001g），瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；VORTEX-5型旋涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；HC-3018型高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；Rayto RT-6100酶标分析仪，深圳雷杜生命科学股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样本分组信息

母乳喂养定义为出生后只采用纯母乳喂养，不添加任何母乳替代品；混合喂养定义为出生后因母乳不足由婴配羊奶粉或牛奶粉补充喂养，且母乳占比约为50%；婴配羊奶粉喂养（婴配牛奶粉喂养）定义为出生后因无法母乳喂养而采用纯婴配羊奶粉喂养（婴配牛奶粉喂养）。

1.2.2 样本的采集

在陕西省杨凌示范区医院采集孕期或哺乳期间无感染性疾病、代谢性疾病及其它恶性消耗性疾病的健康乳母的母乳；足月（＞37周）、正常体重（＞2 500 g）、一月内无腹泻、无胃肠道病史、未使用过任何抗生素类药物的健康婴幼儿。所有样本采集时间为每月25号（±2 d）上午9～12点，样本采集完成均先冻存于-18℃家用冰箱，后于2 h内用冰盒冷链送至实验室，于-80℃冰箱中保存。

粪便样本：当婴儿自然排便后，将新鲜粪便立即收集于无菌干净的粪便采样管中，采样时取粪便中间，避免混入尿液或其他杂物，留取3～5 g于便采样盒内。其中试验共采集0～4月纯母乳喂养的婴儿对应粪便样本51份，样品信息见表1。0～36月龄婴儿粪便114份，详细分组见表2。

表1 粪便样本信息（份）

表2 婴幼儿粪便样本基本信息（个）

母乳样本：采集纯母乳喂养健康乳母1天至4个月的乳汁，采样时，将乳房局部清洁后，直接将乳汁挤入50 mL消毒灭菌的试管中。共采集分娩后6 d内初乳44份，1～4月的成熟乳46份。

表3 母乳样本信息（份）

1.2.3 样本的前处理

母乳样本：吸取母乳样本0.1 mL，按照10%的匀浆比例加入浓度为0.01 mol/L，p H=7.2～7.4的磷酸盐缓冲液，然后以2 000～3 000 r/min离心20 min，弃上层脂质和低层沉淀物，仔细收集中层乳清，-20℃冰柜保存待用。

粪便样本：称取粪便样本0.2 g，按照10%的匀浆比例加入浓度为0.01 mol/L，p H=7.2～7.4的磷酸盐缓冲液，用涡旋混合器震荡10 min，使其充分混匀。2 000～3 000 r/min，离心20 min，收集上清。分装后一份待检测，其余-80℃冷冻备用。

1.2.4 样本中sIgA含量的测定

采用ELISA，按照sIgA试剂盒说明书操作步骤，分别设空白孔、标准孔和待测样品孔，整个实验过程均以复孔操作，其中空白对照不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同。标准品孔准确加入不同浓度梯度sIgA标准品50μL，待测样品孔先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL，轻轻晃动混匀；除空白孔外每孔加酶标试剂100μL，用封板膜封板后置37℃温育60 min；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满20倍稀释后洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干；每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 min；每孔加终止液50μL，终止反应；以空白空调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。

1.2.5 样本中的sIgA含量计算

测量不同浓度梯度的sIgA标准品相应OD值，以OD值为横轴，sIgA标准品为纵轴制作标准曲线，计算回归方程，根据制作的标准曲线计算粪便样本对应的OD值的sIgA浓度。

1.3 统计学方法

所有数据采用IBM SPASSStatistics 20.0统计软件分析；使用Origin 9作图。正态分布的计量资料以均数±标准差表示。方差齐性者组间比较采用方差分析，多重比较使用Duncan法进行，P＜0.05为差异显著，有统计学意义，P＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 sIgA的标准曲线

sIgA标准品按照浓度梯度进行分析，以浓度与所对应的OD值作图，标准曲线见图1，标准品在各自浓度区间范围内，标准曲线为y=29.68 x-1.587，相关系数R2值为0.998，表明线性关系良好。

图1 sIgA的标准曲线

2.2 纯母乳喂养的婴儿中母乳和对应粪便sIgA含量关系

2.2.1 初乳和粪便样本sIgA含量关系

如表4所示，相同天数的条件下，初乳和对应粪便中的sIgA含量差异极显著（P＜0.01），且不同天数的初乳和粪便中的sIgA含量变化趋势相同，表明初乳中sIgA对婴儿粪便中的sIgA有显著影响。

表4 1～6d初乳和粪便样本中sIgA含量 μg·mL-1

2.2.2 成熟乳和粪便样本sIgA含量关系

如表5所示，1～4月，母乳中的sIgA含量均极显著高于纯母乳喂养对应的婴幼儿粪便中sIgA含量（P＜0.01）；且随着月龄的增加，母乳和粪便中的sIgA均呈现上升趋势；母乳和粪便样本中的sIgA含量在不同月龄间的差异性相同，4月龄的sIgA含量与2月龄、1月龄差异显著，2月龄与3月龄sIgA含量差异显著（P＜0.05）。结果说明0～4月龄母乳中sIgA对婴幼儿粪便中的sIgA有影响，母乳能为婴幼儿提供大量的sIgA。

表5 1～4月母乳和粪便样本中sIgA含量 μg·mL-1

2.2.3 月龄对母乳和粪便中sIgA含量的影响

如表6可得，初乳中的sIgA含量显著高于成熟乳中的sIgA含量（P＜0.05），但1～6 d婴幼儿粪便中的sIgA含量虽高于1～4月龄婴幼儿的sIgA含量，但差异不显著（P＞0.05）。这与王凤英[10]等人之前的研究结果相似，表明母乳中sIgA的产生和分泌与婴幼儿肠道中sIgA的产生和分解能力可能是相适应的，使得婴儿在自身的肠道免疫功能尚未成熟之前可以得到稳定的免疫保护。

表6 母乳和粪便样本在不同时间段的sIgA含量 μg·mL-1

2.3 分娩方式对婴幼儿粪便中sIgA含量的影响

其中“*”表示分娩方式组间差异显著，P＜0.05；“**”表示组间差异极显著，P＜0.01。

由图2可知，在0～36月龄范围内，不同喂养方式下的顺产婴幼儿粪便中的sIgA含量与剖宫产婴儿的差异显著。在0～6月龄时，纯母乳、混合、婴配羊奶粉喂养组顺产婴儿的sIgA显著高于同组剖宫产婴儿（P＜0.01）。在6～12月龄时，纯母乳、混合、婴配牛奶粉喂养组顺产婴儿的sIgA显著高于同组剖宫产婴幼儿（P＜0.05）。12～36月龄时，婴配羊奶粉、婴配牛奶粉喂养组顺产婴儿的sIgA含量均显著高于同组剖宫产婴儿组（P＜0.01）。结果说明在0～36月龄内，顺产婴儿的肠道健康要优于剖宫产婴幼儿的肠道，这可能是由顺产婴儿与剖宫产婴儿肠道菌群组成差异引起的。已有研究证实，定殖在婴幼儿肠道中的早期微生物会受分娩方式的影响[11-12]。顺产婴儿肠道中内富含双歧杆菌、埃希氏菌和拟杆菌等，剖宫产婴儿则有较多的肠球菌和肠杆菌等[13-14]。其中，双歧杆菌具有促进婴幼儿肠道sIgA分泌的作用[15-16]。另外，分娩方式也可通过影响母乳中sIgA的含量，影响婴幼儿肠道内sIgA的含量。Shao等人[14]研究发现，顺产组的初乳中sIgA含量显著高于剖宫产组。由此可知，顺产组婴儿粪便中sIgA含量高于剖宫产喂养组，可能是剖宫产会破坏双歧杆菌在母婴间的传递，引起新生儿的肠道菌群失衡，或是通过降低母乳中的sIgA含量，造成婴幼儿肠道中sIgA的含量降低。

2.4 喂养方式对婴幼儿粪便中sIgA含量的影响

如表7所示，0～12月龄时，在分娩方式相同且同月龄的婴幼儿中，纯母乳喂养组婴幼儿sIgA含量较高，显著高于婴配牛奶粉和羊奶粉喂养的婴幼儿（P＜0.05），结果与Hua[17]和Bakker-Zierikzee[18]的研究结果是一致的，这可能因为在0～12月龄内，婴儿自身合成sIgA的能力较弱，主要依靠母乳摄入。母乳喂养组婴幼儿sIgA含量和混合喂养组无显著差异（P＞0.05）；婴配羊奶粉、婴配牛奶粉喂养组sIgA水平显著低于混合喂养组（P＜0.05），这可能是婴幼儿粪便中sIgA含量与母乳喂养量呈正相关[5]。母乳中sIgA可进入新生儿及婴儿胃肠道，防止病原微生物的侵入，保护婴儿胃肠道免受感染[19]。母乳喂养的婴幼儿肠道中双歧杆菌数量较高[20]，可促进儿童肠道sIgA分泌。而且母乳能促使婴儿局部免疫系统发育成熟，增加婴儿自身肠道sIgA的产生[21]。说明，在0～12月龄内，母乳喂养对婴儿肠道健康更重要。

表7 不同喂养方式对婴幼儿粪便中sIgA含量的影响

0～36月龄内，婴配羊奶粉喂养组的婴幼儿粪便中sIgA含量均显著高于婴配牛奶粉喂养组（P＜0.05）。这一结果与杨莉[22]和王逸斌[23]研究证实的婴配羊奶粉对婴儿健康成长有一定促进作用的结果一致。相关研究证明羊乳具有低致敏性和高营养价值的特点，更适合作为婴幼儿配方奶粉的原料[24-27]，与本研究婴配羊奶粉喂养的婴儿sIgA含量是高于婴配牛奶粉的结果相符。

2.5 月龄对婴幼儿粪便中sIgA含量的影响

图3 不同月龄对婴幼儿粪便中sIgA含量的影响

如图3可知，不同喂养方式下，随着月龄的增长，婴幼儿粪便中的sIgA含量呈递增趋势。其中，婴配羊奶粉顺产组0～6月、6～12月和12～36月的sIgA含量显著增加（P＜0.01），剖宫产组0～6月到6～12月的sIgA含量显著增加（P＜0.01），但6～12月和12～36月剖宫产婴幼儿的sIgA含量增加不显著（图3a）。婴配牛奶粉顺产组0～6月、6～12月和12～36月的sIgA含量增加显著（P＜0.01），剖宫产组0～6月到6～12月的sIgA含量增加不显著（P＞0.05），但6～12月到12～36月增加显著（P＜0.01）（图3b）。纯母乳喂养组、混合剖宫产喂养组在0～6月到6～12月的sIgA含量增加显著（P＜0.01），混合顺产婴儿的sIgA含量在0～6月到6～12月增加显著（P＜0.05）（图3c、3d）。随月龄的增长，纯母乳喂养组、混合喂养组、婴配羊奶粉喂养组和婴配牛奶粉喂养组粪便的sIgA含量均出现了显著递增的趋势，且12～36月龄喂养组婴儿粪便中sIgA的含量显著高于0～6月和6～12月的水平。有研究指出维生素C能促进肠道sIgA含量的增加[5]。水果和蔬菜作为婴幼儿12月以后最常见的辅食，是维生素C的主要食物来源[28]。因此，随着月龄的增加，sIgA含量呈现上升的趋势，是因为婴幼儿随辅食的逐渐引入，饮食的种类趋向多样化，摄入营养更加丰富，肠道微生物丰度差异变大，使得婴儿肠道自身产生了大量的sIgA[29]。

3 结论

本研究通过酶联免疫分析技术探讨了不同月龄、喂养方式和分娩方式对婴幼儿肠道内sIgA含量的影响，评估婴幼儿不同阶段的免疫健康状态。研究发现：母乳在4个月内能够为婴幼儿提供大量的sIgA，母乳中的sIgA含量均极显著高于对应婴幼儿粪便组的sIgA含量，不同时间的母乳和粪便中的sIgA含量有着相同的变化趋势。0～36月龄，婴幼儿顺产组sIgA含量明显高于剖宫产组；母乳喂养婴幼儿sIgA含量最高，混合喂养组次之，婴配羊奶粉喂养sIgA含量显著高于婴配牛奶粉喂养；随着月龄增长，婴幼儿粪便中的sIgA含量明显呈现上升的趋势。因此，为保证婴幼儿的肠道免疫健康和科学合理喂养，婴儿在出生时尽可能选择顺产，产后保持母乳喂养。本研究为婴幼儿的科学喂养提供理论依据，为婴幼儿的健康、免疫状态的预判提供参考依据。