沈荷玉，蒋莹，唐婉婷，姜荣杰，周可强，李辰凤，李诚

（四川农业大学食品学院，四川雅安625000）

0 引言

乳清是生产干酪的副产物，约含0.6%的乳清蛋白，这部分乳清蛋白还没有被大量开发利用[1-2]。工业化生产干酪会排放出大量的乳清，因此乳清资源丰富[3-4]。我国已将乳清作为原料研制各种乳清饮料[5-6]，且酶法水解的乳清饮料，感官性质良好[7]。

乳清多肽有抗高血压、抗氧化等多种功能，还可以改善乳清蛋白的加工性能，而近年来乳清功能性多肽的研究也已成为热点[8-10]。本研究以鲜牛乳为原料，采用复合酶（中性蛋白酶和木瓜蛋白酶）一步法酶解乳清制备抗氧化肽，以羟自由基清除率为指标，优化酶解工艺条件，并将在最佳酶解条件下制得乳清酶解液和其他配料一起调配成桑葚枸杞乳清多肽复合饮料，为乳清功能饮料的生产加工提供一定的实验和理论基础。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂

鲜牛乳（四川农业大学农场生产）、水（GB/T6682规定的三级水）、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、氢氧化钠、对硝基苯酚、乙酸钠、无水乙酸钠、乙酸、37%甲醇、乙酰丙酮、盐酸、中性蛋白酶（50 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢、乙醇、乙酸、磷酸、硫酸铁铵（均为分析纯）。

1.1.2 仪器

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，上海力辰邦西仪器科技有限公司；Phs-3C+酸度计，方舟科技；JA12038电子天平，上海越平科学仪器有限公司；Varioskan las荧光酶标仪，美国Thermo；Thermo Sorvall ST 16 ST16R通用台式离心机，赛默飞世尔科技公司。

1.2 方法

1.2.1 乳清制备

（1）巴氏杀菌：鲜牛乳76℃杀菌20 s，放入冰水降温。

（2）脱脂：取50 mL离心管装入样品，转速8 000 r/min，4℃离心20 min。将下层清液（脱脂乳）沿管壁缓慢倒入烧杯，底部沉淀丢弃。

（3）制备乳清：使用磁力搅拌器（低速搅拌）和p H计，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH滴定至pH值为4.6，静置30 min，用四层纱布过滤备用。

1.2.2 复合酶一步水解乳清的单因素实验

选择不同酶解温度（47.5，50，52.5，55，57.5℃），不同酶解pH值（6，6.5，7，7.5，8），不同酶量比例（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1）3个因素进行单因素试验，实验结果以羟自由基清除率为评价标准来确定合适的酶解条件范围，以便进行后续响应面优化实验。

1.2.3 复合酶一步水解乳清的响应面优化实验

在单因素实验的基础上，以水解温度、pH值、酶比（中性蛋白酶：木瓜蛋白酶）3个因素为自变量，以乳清多肽的羟自由基清除率为响应值，设计3因素3水平响应面分析实验，以Design-Expert8.0.6软件对实验进行回归分析[11]，响应面实验因素和水平如表1所示。

1.2.4 桑葚枸杞乳清多肽复合饮料配制

（1）制备乳清。

（2）将制得乳清在羟自由基清除率最高的条件下水解得乳清水解液。

（3）枸杞子→挑选→清洗→除杂去梗→粉碎过筛（40目）→取枸杞粉→煮沸的乳清水解液浸泡30 min→四层纱布200目筛子过滤→取清液备用。

（4）桑葚干→挑选→清洗→除杂去梗→粉碎过筛（40目）→取桑葚粉→煮沸乳清水解液（用浸泡过枸杞过滤后的乳清水解液）浸泡30 min→四层纱布200目筛子过滤→取清液备用。

（5）取浸泡过枸杞粉和桑葚粉的乳清水解液→加入蜂蜜→加入柠檬酸→调配→均质（20 MPa）→杀菌（121℃，5 min）→灌装（100 mL玻璃瓶）→二次杀菌（121℃，1 min）→冷却→成品。

工艺流程为：

1.2.5 桑葚枸杞乳清多肽复合饮料配方的正交实验

考虑到乳清多肽饮料产品配方的交互影响，以桑葚（A）、枸杞（B）、柠檬酸（C）、蜂蜜（D）为因素，设计三因素三水平正交实验，以感官评定作为指标，确定桑葚枸杞乳清多肽复合饮料的最适配方。

1.3 指标测定方法

1.3.1 蛋白质含量的测定

参照国标GB/T 5009.5-2016[12]。

1.3.2 羟自由基清除率的测定

在试管中加入0.5 mL浓度10 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、0.5 mL样液、0.5 mL浓度10 mmol/L的FeSO4溶液、3.5 mL蒸馏水，最后加入5 mL浓度100 mmol/L的H 2O 2启动Fenton反应，摇匀后于510 nm处测定吸光度A 1；取0.5 mL的蒸馏水代替浓度10 mmol/L的FeSO 4溶液所测得的吸光度为A2；取0.5 mL的蒸馏水代替水解液所测得的吸光度为A3[13]。

羟自由基的清除率P(%)

式中：A1为样品平均吸光值；A2为对照组平均吸光值；A3为空白组平均吸光值。

1.3.3 感官评价

参照GB/T 29605-2013，由10人组成评价小组，按表2指标对产品的色泽、味道、风味等进行综合感官评价[14]。

表2 感官评定评分指标

2 结果与讨论

2.1 乳清中的蛋白质质量浓度

以光密度读数A为纵坐标，氨氮标准液氮含量C（μg）为横坐标，绘制标准曲线，得到氨氮标准液氮含量C与吸光度A关系为A=0.0134C+0.007。

乳清样品的吸光度A测定值为1.115，计算得蛋白质质量浓度为5.3 mg/mL。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 温度对复合酶一步水解乳清得抗氧化肽的影响

由图1可知，在其他因素相同的条件下，温度为47.5，50，52.5℃时乳清多肽抗氧化性不高，羟基自由基清除率较低；当温度为55℃时，羟自由基清除率达到最大值58.41%；一方面，温度过低，不能使蛋白酶的特殊空间结构充分舒展，促使活性不能充分发挥[15]。另一方面，当温度升高时，酶活力有所下降，导致蛋白质裂解肽键的速度减慢，小分子的肽数目减少，清除自由基的能力下降，所以乳清多肽的羟自由基清除率反而降低[16]。温度的改变影响复合酶的活性，在适宜温度范围内，温度升高，蛋白酶水解能力增强，进而影响具有抗氧化功能的酶解物含量。因此确定温度55℃比较适合复合酶的一步酶解。

图1 温度对羟自由基清除率的影响

2.2.2 p H值对复合酶一步水解乳清得抗氧化肽的影响

由图2可知，在其他因素相同的条件下，pH值为6时乳清多肽抗氧化性不高，羟基自由基清除率较低；当pH值为6.5时，羟自由基清除率达到最大值52.41%；当p H值不断增大时，乳清多肽的羟自由基清除率反而不断降低。溶液p H是决定复合蛋白酶催化活性的重要参数之一，过高或者过低都会对酶解反应产生不利影响，导致羟自由基清除率下降[17-18]。因此确定p H值为6.5是比较适合复合酶的一步酶解。

图2 pH值对羟自由基清除率的影响

2.2.3 酶比对复合酶一步水解得抗氧化肽的影响

由图3可知，在其他因素相同的条件下，酶比为1∶1和2∶1时乳清多肽抗氧化性不高，羟基自由基清除率较低；当酶比为3∶1时，羟自由基清除率达到最大值49.11%；当酶比增大时，乳清多肽的羟自由基清除率反而降低。酶比的改变影响酶解效果，每一种酶有专一的酶切位点，专一性不同的两种酶组合起来，能更多地切断多肽链，因而提高酶解效果[19]。因此确定酶比3∶1比较适合复合酶的一步酶解。

2.3 响应面实验优化结果

图3 酶比对羟自由基清除率的影响

表3 水解方案响应面分析及结果

采用响应面软件设计3因素3水平的响应面优化实验，以羟自由基清除率为响应值，结果如表3所示。

2.3.1 响应面分析及方差分析

根据表1,采用Design-Expert8.0.6软件对表3中的试验结果进行多元回归拟合分析，对各因素回归拟合后，得出羟自由基清除率对温度（A）、pH值（B）、酶比（C)的回归模型，回归方程为：

由表4可以看出，A2和C2对羟基自由基清除率影响高度显著，B2对羟基自由基清除率影响显著，A对羟基自由基清除率影响较显著。其中，失拟项=0.9909（＞0.05）即失拟项差异不显著，表明该回归模型能够较显著拟合。温度、pH值、酶比对羟基自由基清除率的影响，该模型能够代替试验真实点对试验结果进行分析。

2.3.2 最优水解条件的预测及验证

运用Design-Expert8.0.6软件对试验数据进行优化预测，即对回归方程取一阶偏导数等于0，得到羟自由基清除率最高的最佳水解参数：温度55.22℃，pH值为6.46，酶比31∶10，在此条件下羟基自由基清除率的值为68.08%。在此条件下对模型的预测参数进行3次平行验证试验，得到羟自由基清除率为67.70%，与模型预测值接近，表明采用响应面分析法优化得到的水解条件是可靠的。

表4 响应面ANOVA分析结果

2.3.3 响应面分析及优化

响应面可以反映出各因素间交互作用的显著性，曲面变化相应表现为响应值变化的大小[20]。由图4可知，温度、pH值、酶比（中性蛋白酶：木瓜蛋白酶）3个因素之间存在交互作用。图4（a）为温度与p H值的交互结果：响应面曲面坡度较陡峭，且温度更为陡峭，说明二者交互作用显著，温度的影响大于pH值的影响。图4（b）为温度和酶比的交互结果：响应面曲面坡度较陡峭，且温度更为陡峭，说明二者交互作用显著，温度的影响大于酶比的影响。图4（c）为p H值和酶比的交互结果：响应面较为平缓，且等高线呈圆形，说明两者交互作用不显著。

2.4 桑葚枸杞乳清多肽复合饮料配方优化的正交试验结果

由表5可得，影响桑葚枸杞乳清多肽复合饮料风味的主次关系为B、A、C、D。正交试验最适配方为A3B3C2D1，即柠檬酸0.13%、蜂蜜5.5%、桑葚4.0%、枸杞1.2%，该配方产品色泽均匀，口感酸甜，品质稳定。

表6表明，柠檬酸量、桑葚量、枸杞量对饮料最终口感的影响不显著，而蜂蜜量对口感的影响显著，直接影响饮料的酸甜风味。

3 结果与讨论

目前，酶法制备乳清多肽一般都采用单一酶酶解制备的方法，如李雪等采用胃蛋白酶酶解乳清制备多肽[21]，唐艳等采用中性蛋白酶酶解乳清制备多肽[22]。但复合酶酶解乳清蛋白，可以结合不同酶的酶切位点，更多的切断多肽链，促进酶解过程，提升乳清多肽的抗氧化性。多数乳清饮料研究采用乳清直接调配制备乳清饮料，如孟昭嘘等以食用仙人掌、白糖等和乳清混合调配成仙人掌乳清饮料[23]。但利用乳清直接调配饮料时，热处理往往导致乳清蛋白的变性沉淀，十分影响产品的感官特性和营养价值，而酶水解正是改善乳清蛋白溶解性的有效方法。

图4 各因素交互作用对乳清多肽羟基自由基清除率影响的响应面

表6 感官评定方差分析结果

复合酶酶解制备抗氧化肽的最优酶解工艺条件为温度为55.22℃，pH值为6.46，酶比（中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶）为31∶10。经过验证与对比实验可知在最优酶解工艺条件下羟自由基清除率可达到67.70%。且利用响应面分析三个因素的交互作用的影响顺序是：温度＞酶比＞pH值。以酶解的乳清液为基本原料制备的桑葚枸杞乳清多肽复合饮料配方为：桑葚4.0%，枸杞1.2%，柠檬酸0.13%，蜂蜜5.5%（均为质量分数）。