李继庭 梁虹宇 苏立芬

1广东省第二中医院，广州 510095

2广州市白云区人民医院，广州 510500

流行性感冒简称流感，是由流感病毒导致的急性呼吸道疾病，具有传染性高、传播速度快、易流行等特点，严重危害人类健康[1]。疫苗保护作用是目前流感预防的重要举措之一，然而由于病毒的变异速度较快，且疫苗不能对所有人群完成有效免疫，疫苗的有效利用率达不到预期效果。神术散来源于《医方类聚》，主治伤寒伤风，症见头疼身痛、发热恶寒无汗，功能祛风解表止痛[2]。本研究采用加味神术散雾化剂进行体外抗流感病毒实验，旨在寻找有效且毒副作用小的抗流感病毒药物，为流感的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物

实验组药物为自制加味神术散雾化剂，基本药物组成及剂量为苍术20 g，羌活、白芷、金银花、野菊花、藿香各10 g，甘草5 g，冰片0.3 g，由上述药物制成的水提剂，取15剂水煮蒸馏，经浓缩后得到黄色精油，通过乙醚将油反复溶出，加入无水Na2SO4脱水干燥，药物浓度为1 g/mL。对照组药物为利巴韦林注射液(宜昌人福药业有限责任公司，国药准字H20033945)。

1.2 试剂和仪器

3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(上海江莱生物科技有限公司)5 mg/mL，避光-20 ℃保存备用；小牛血清培养液(维森特生物技术有限公司)；CO2培养箱(上海博讯，BC-J160S)；倒置荧光电子显微镜(Leica，DMI3000B)；酶标仪(Thermo，MULTISKAN MK3)；超净工作台(上海博讯，SW-CJ-2FD)。

1.3 病毒株

甲型H1N1流感病毒及狗肾传代细胞(MDCK cell)由中国疾病预防控制中心国家流感中心提供，使用前在9日龄鸡胚尿囊腔接种传代，每胚接种0.2 mL，经过37 ℃恒温培养72 h后收集尿囊液，3000 r/min条件下离心15 min，取上清液进行血凝实验，取尿囊液测定病毒血凝滴度为1：512且细菌培养阴性的病毒液进行分装，置-80 ℃冰箱保存备用。

1.4 实验方法

1.4.1 MDCK细胞的培养 液氮内取出MDCK细胞，37 ℃条件下水浴，离心后弃细胞上清液，加入10%小牛血清培养液9 mL，分布均匀后加入细胞培养瓶，37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。将长满单层的MDCK细胞以PBS液洗，加入2.5 mL 0.5%胰酶与EDTA；当细胞收缩变圆到将要脱落时，加入1 mL含血清的细胞培养液，吹落细胞，以离心管收集消化终止液，1500 r/min离心5 min；弃上清液，加入含血清的细胞培养液，重新悬浮细胞后分装，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后备用。

1.4.2 流感病毒液的制备 将鸡胚气室朝上放置于蛋盘，用75%酒精消毒气室端，钻孔，吸取病毒液注射到鸡胚尿囊腔。37 ℃培养鸡胚，在收获尿囊液前应放置4 ℃过夜。吸取鸡胚尿囊液，于3000 r/min条件下离心5 min收集上清液，-80 ℃冰箱保存。

1.4.3 流感病毒收集液血凝滴度的测定 血凝板待测孔内每孔加入0.05 mL生理盐水，吸取等体积含病毒的鸡胚尿囊液于第1孔，混匀后依次对倍稀释。依次从左至右每孔加入1%鸡红细胞悬液0.05 mL。将血凝板置于振荡器上振荡，37 ℃恒温培养箱中放置10 min，出现完全凝集孔内病毒的最高稀释度，即为血凝滴度(HA)。

1.4.4 流感病毒对MDCK细胞毒力的测定 MDCK细胞贴壁长成完整的单层后，弃上清液，PBS洗细胞3次。取病毒生长液按10倍梯度稀释为10-1～10-10，以100 μL/孔将不同浓度的病毒液加入MDCK细胞中，每个稀释度平行做3个复孔。同时设置正常细胞作为对照组，孔内不加病毒，只添加细胞培养液。置于37 ℃、5%CO2培养箱中流感病毒吸附MDCK细胞1 h后取出，弃上清液，PBS洗涤3次，病毒组每孔加病毒生长液150 μL，正常细胞对照组加150 μL细胞培养液，置于37 ℃、5%的CO2培养箱中继续培养。细胞病变(CPE)分级的判定方法:0%CPE为“-”，1%～25%CPE为“+”，25%～50%CPE为“++”，50%～75%CPE为“+++”，75%～100%CPE为“++++”；当最高浓度病毒液孔内MDCK细胞CPE达到+++～++++时，取各孔上清液作血凝试验，采用Reed-Muench法计算流感病毒对MDCK细胞的半数细胞感染量(TCID50)。

1.4.5 药物对MDCK细胞毒性的测定 依照MTT法检测药物对MDCK细胞的毒性。MDCK细胞长成完整的单层后，弃上清液，PBS洗3次，更换含不同浓度的含药细胞培养液，150 μL/孔。以1000 μg/mL加味神术散雾化剂作为最大浓度药物组，用培养液按2倍梯度稀释药物，测定药物对MDCK细胞的毒性范围。每个药物浓度平行做3复孔，同时设置正常细胞对照组(不加病毒，只加150 μL细胞培养液)，37 ℃、5%CO2培养箱中培养，观察CPE。当高浓度药物组细胞CPE达到+++～++++时，采用MTT法在482 nm处测定光密度(OD)值，计算细胞破坏率；通过Probit回归计算药物半数中毒浓度(TC50)与药物最大无毒浓度(TC0)。

1.4.6 药物对流感病毒增殖抑制作用的测定 MDCK细胞长成完整的单层后，弃上清液，PBS洗3次，按照100 μL/孔加入10倍TCID50流感病毒液，置于37 ℃、5%的CO2培养箱中吸附1 h，弃上清液，PBS洗3次，设置正常细胞对照组、病毒对照组及利巴韦林阳性对照组，每个药物浓度平行做3复孔。选择TC0作为最高浓度，将病毒生长液作2倍稀释，然后按照150 μL/孔加入药物孔中。正常细胞对照组内不加病毒，只加细胞培养液；病毒对照组加病毒生长液；利巴韦林阳性对照组先加入不同浓度的利巴韦林，清洗后加入病毒生长液。根据病毒复制周期，设计3种不同加药方式观察加味神术散雾化剂的抗病毒效果：直接抑制组同时加入病毒生长液与不同浓度的加味神术散雾化剂；治疗组先加入病毒生长液，清洗后加入不同浓度的加味神术散雾化剂；预防组先加入不同浓度的加味神术散雾化剂，清洗后加入病毒生长液。37 ℃、5%CO2培养箱中培养，观察CPE。当高浓度药物组细胞达到+++～++++时，采用MTT法在482 nm处测定OD值，计算病毒增殖抑制率，通过Probit回归计算半数抑制浓度(IC50)和治疗指数(TI)，TI=TC50/IC50。

2 结果

2.1 病毒毒力测定

由血凝实验结果可见，流感病毒稀释到10-8时，开始出现血凝阴性；稀释至10-10时，未见血凝发生。根据Reed-Muench法计算甲型H1N1流感病毒对MDCK细胞的TCID50为10-8/0.1 mL。见表1。

表1 流感病毒对MDCK细胞的毒力

2.2 药物毒性测定

通过Probit回归法计算加味神术散雾化剂对MDCK细胞的TC50为366.63 μg/mL，TC0为31.25 μg/mL；利巴韦林对MDCK细胞的TC50为109.85 μg/mL，TC0为8.02 μg/mL。见表2。

表2 药物对MDCK细胞的毒性

2.3 药物对流感病毒增殖的抑制作用

通过Probit回归法计算加味神术散雾化剂直接抑制流感病毒的IC50=9.79 μg/mL，TI=37.45；预防流感病毒感染的IC50=8.72 μg/mL，TI=42.04；治疗流感病毒感染的IC50=17.40 μg/mL，TI=21.07。利巴韦林预防流感病毒感染的IC50=84.30 μg/mL，TI=1.30。见表3。

表3 药物对流感病毒增殖的抑制作用

3 讨论

流行性感冒临床表现为发热、咽痛、肌痛、咳嗽等呼吸道症状，以及腹泻、腹痛、恶心等消化道症状，少数患者甚至出现多脏器功能障碍综合征、急性呼吸窘迫综合征等，病死率较高，可发生于任何年龄段，患病不存在性别差异，目前以12岁以下儿童发病率较高[3]。目前治疗流感的常见化学药物包括4种类型：M2离子通道抑制剂例如金刚烷胺，可作用于流感病毒膜蛋白以及血凝素蛋白，有效阻止病毒进入宿主细胞；神经氨酸酶抑制剂例如奥司他韦，可抑制神经氨酸酶活性，阻止病毒颗粒的释放，切断病毒的扩散链；抑制流感病毒核酸合成药物例如利巴韦林，可损害病毒RNA和蛋白合成，从而抑制病毒的复制与传播；以及非特异性抗病毒药物例如干扰素，可广谱抑制病毒的繁殖，通过诱导细胞合成抗病毒蛋白体而发挥作用[4]。以上化学治疗药物虽具有一定的抗病毒作用，但可能导致较为严重的不良反应。

我国很早就开始研究中药抗流感作用，加味神术散主要由苍术、白芷、川穹、藁本、羌活、细辛、炙甘草7味药物组成，其中苍术燥湿健脾、祛风散寒，白芷解表散寒、祛风止痛，川芎活血行气、祛风止痛，藁本祛风散寒、除湿止痛；羌活解表散寒、祛风胜湿止痛，细辛祛风通窍、散寒止痛，炙甘草调和诸药；诸药合用，共奏解表散寒、祛风除湿之效。本课题组前期研究[5]发现，加味神术散雾化剂可下调甲型流感病毒鼠肺适应柱FM1感染小鼠NLRP3炎性小体及其下游因子IL-1β、IL-18的分泌水平，可能对其产生免疫保护机制。本研究通过体外细胞实验探讨加味神术散雾化剂抗流感病毒的效果，由于利巴韦林对流感病毒甲型、乙型均有较为明确的抑制作用，因此本研究中选用其作为阳性对照药物。

TCID50是指能引起50%细胞出现细胞病变效应的待测病毒量，反映病毒致细胞病变的能力，是检测病毒感染性和毒力的指标。根据Reed-Muench法计算甲型H1N1流感病毒对MDCK细胞的TCID50为10-8/0.1 mL。加味神术散雾化剂对MDCK细胞的毒性作用表现为细胞颗粒较多，增殖缓慢，形态改变，部分细胞破碎脱落。加味神术散雾化剂对MDCK细胞的毒性作用随着药物浓度的升高而升高，细胞破坏率随药物浓度的降低而降低。本研究中加味神术散雾化剂对MDCK细胞的TC50为366.63 μg/mL，TC0为31.25 μg/mL；利巴韦林对MDCK细胞的TC50为109.85 μg/mL，TC0为8.02 μg/mL。说明加味神术散雾化剂对MDCK细胞的毒性低于利巴韦林，达到相同细胞破坏率需要更高的药物浓度。

本研究中利巴韦林预防流感病毒感染的IC50=84.30 μg/mL，TI=1.30；加味神术散雾化剂直接抑制流感病毒的IC50=9.79 μg/mL，TI=37.45；预防流感病毒感染的IC50=8.72 μg/mL，TI=42.04；治疗流感病毒感染的IC50=17.40 μg/mL，TI=21.07。TI=TC50/IC50，是反映药物对病毒抑制作用的评价指标。研究结果显示，加味神术散雾化剂预防组TI达到42.04，明显高于利巴韦林组的1.30；表明加味神术散雾化剂预防流感病毒感染的作用确切。采用不同加药方式给予MDCK细胞加味神术散雾化剂处理，其抗流感病毒效率存在差异，在相同药物浓度下，预防组的病毒破坏率显著高于直接抑制组和治疗组；这可能是由于加味神术散雾化剂阻断病毒侵入细胞的作用较强。在药物最大无毒浓度下，加味神术散雾化剂表现出对流感病毒细胞内增殖有明显的抑制作用，且病毒增殖抑制率随着药物浓度的增加而增加；提示加味神术散雾化剂与利巴韦林一样，其抗流感病毒作用效果随着药物剂量的增加而增强。

综上所述，加味神术散雾化剂可明显抑制甲型H1N1流感病毒在MDCK细胞中的增殖，具有抗甲型H1N1流感病毒作用。