宗亚仙 郝自远 王曦 温少莹 李火根

摘 要：鵝掌楸（Liriodendron chinense）为重要的珍贵用材及园林观赏树种，开展抗逆基因的研究，对于提高鹅掌楸适应性有重要意义。该文以鹅掌楸为研究对象，通过采用RT-qPCR与RACE相结合的方法克隆获得3个AOX基因，其ORF长分别为858、1 032、1 044 bp，相应编码氨基酸数为285、343、347 aa，分别命名为LcAOX1a、LcAOX1b和LcAOX2。蛋白同源性分析发现鹅掌楸AOX家族蛋白序列高度保守，尤其在C端保守性极高，且均含有“EXXH”、“EEE-Y” 铁离子结合保守结构域。亚细胞定位分析结果显示LcAOX1a蛋白定位于线粒体及叶绿体之外的其他位置，LcAOX1b蛋白在叶绿体和线粒体中均有定位，LcAOX2蛋白定位于线粒体基质。采用RT-qPCR方法研究AOX基因在鹅掌楸茎、叶片、叶芽、花芽、花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊8个不同组织中的表达模式，分析发现鹅掌楸AOX基因在花器官中表达量明显高于营养器官，LcAOX1a与LcAOX1b基因在雄蕊中表达量最高，特别是LcAOX1a基因在雄蕊中特异性表达，其表达量远远高于其他组织;LcAOX2基因在花瓣中表达量最高。该研究克隆3个鹅掌楸AOX基因并进行相关分析，为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

关键词：鹅掌楸，交替氧化酶，基因克隆，生物信息学分析，组织表达

中图分类号：Q943

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2020）07-0988-10

Abstract：Alternative oxidase （AOX），a terminal oxidase located in respiration electron-transport pathway，which is widely existed in higher plants and closely related to plant respiration. It has shown that AOX played a substantial role in plant growth，seedling morphogenesis and environmental adaptability in recent researches. Liriodendron chinensis is an excellent tree species for garden ornaments and timber use，while the adaptive capacity prevents the expansion of cultivated area. As a result，searching for resistant genes of L. chinensis and uncovering the mechanism of its stress-defence ability are great urgency. Three AOX genes were isolated from L. chinensis by RT-qPCR and RACE，and then sequence analysis was carried out in silico，including analysis of open reading frames，encoded amino acid sequences，protein domains，secondary structures and so on. The open reading frame length of AOX genes were 858，1 032 and 1 044 bp，which encoded 285，343 and 347 amino acids，respectively，and then we named the genes as LcAOX1a，LcAOX1b and LcAOX2. Protein homology and phylogenesis analysis revealed that the AOX family protein sequences of L. chinense were highly conserved，especially at the C-terminus，and all the three AOX genes contained “EXXH”，“EEE-Y” iron-binding conserved domains，those may have activities in combination with iron ions. Subcellular localization analysis showed that LcAOX1a protein was localized in other places outside the chloroplast and mitochondria. LcAOX1b protein was localized in chloroplast and mitochondria，while LcAOX2 protein was localized in mitochondrial matrix. The expression patterns of AOX genes were examined by using eight tissues，including stem，leaf，leaf bud，flower bud，calyx，petal，stamens and pistil. The result of RT-qPCR indicated that relative quantity （RQ） of LcAOX1a，LcAOX1b and LcAOX2 genes in floral organs was significantly greater than that in vegetative organs. The RQ value of LcAOX1a and LcAOX1b was the highest in the stamens，especially the LcAOX1a，the expression in the stamens was much higher than other tissues. The LcAOX2 gene has the highest RQ value in the petals. This study cloned three LcAOX genes and performed bioinformatics analysis，subcellular localization analysis and expression patterns analysis to provide a reference for further study of their biological functions.

1.2.4 基因的生物信息学分析 利用生物信息学软件对获得的AOX基因进行开放阅读框、编码的氨基酸序列、蛋白质结构域及二级结构等分析。通过ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）进行ORF及编码氨基酸序列的预测;通过Expasy ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）进行蛋白质氨基酸组成、分子量、理论等电点分析;使用Pfam（http：//pfam.xfam.org/）进行蛋白质结构域分析;采用在线工具ExPASy TMpred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）分析蛋白質序列跨膜区;使用SignalP 4.1 Sever（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行信号肽分析;使用SOPMA进行蛋白质二级结构预测;分别利用TargetP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）及Wolfpsort（https：//wolfpsort.hgc.jp/）进行亚细胞定位预测;在NCBI搜索下载已发表的AOX同源序列进行分析，采用MEGA5.0进行系统进化树构建。

1.2.5 基因的组织表达分析 提取鹅掌楸叶片、茎、叶芽、花芽、花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊8个不同组织的RNA，将提取的RNA样品稀释到统一浓度（250 ng·μL-1），反转录呈cDNA。根据克隆获得LcAOX1a、LcAOX1b和LcAOX2基因序列，采用Oligo 7软件设计qPCR引物（表1），用Actin97作为内参基因，进行实时定量PCR反应，检测目的基因在8种不同组织中的表达量，每个样品设置3个重复，反应体系和程序参照SYBR Premix Ex TaqTM （Tli RNaseH Plus）（TaKaRa）说明书。

2 结果与分析

2.1 鹅掌楸AOX家族基因cDNA全长序列克隆及命名

从北美鹅掌楸转录组数据库搜索到AOX基因相关的EST片段共16条，分别将其EST片段与本实验室鹅掌楸转录组数据（Yang，2013）比对、去重之后，共得到3条鹅掌楸AOX基因EST片段，分别为lcomp84206_c0、lcomp98789、lcomp99880_c0，并根据筛选出的3条鹅掌楸AOX基因EST序列设计中间片段特异性引物，通过PCR扩增、目的片段回收以及克隆测序，对转录组中AOX基因序列进行验证（图1：A）。根据中间片段测序结果设计RACE引物，采用巢式扩增，获得3′RACE（图1：C）和5′RACE（图1：D）。将中间片段、3′RACE和5′RACE进行电子拼接获得全长，并在其ORF两端设计引物进行ORF验证（图1：B），表明拼接结果无误。将克隆获得的3个AOX基因预测蛋白通过NCBI BLAST Protein与数据库进行比对，根据比对结果，将获得的目的基因依次命名为LcAOX1a（MN187966）、LcAOX1b（MN187968）和LcAOX2（MN187967）。

2.2 鹅掌楸AOX家族基因编码蛋白理化性质分析

克隆出的3个AOX基因编码蛋白均含有AOX保守结构域，其中LcAOX1a、LcAOX1b为AOX1亚家族，LcAOX2为AOX2亚家族成员。LcAOX1a基因全长1 305 bp，ORF长858 bp，编码285个氨基酸，理论等电点为7.23，脂溶性蛋白指数为80.11，不稳定系数为36.17，疏水性平均值为-0.264。LcAOX1b基因全长1 405 bp，ORF长1 032 bp，编码343个氨基酸，理论等电点为8.37，脂溶性蛋白指数为85.04，不稳定系数为39.71，疏水性平均值为-0.181。LcAOX2基因全长1 376 bp，ORF长1 044 bp，编码347个氨基酸，理论等电点9.02，脂溶性蛋白指数为89.94，不稳定系数为48.17，疏水性平均值为-0.251。通过在线预测软件ExPASy TMpred对AOX蛋白跨膜区进行解析，结果显示AOX蛋白为典型的跨膜蛋白，且疏水性变化大的区域为其跨膜区。

2.3 鹅掌楸AOX家族基因编码蛋白同源性分析

分别将鹅掌楸AOX家族蛋白的LcAOX1a、LcAOX1b、LcAOX2与NCBI数据库数据库中序列进行比对，结果表明鹅掌楸AOX家族蛋白序列高度保守，尤其在C端保守性极高（图2），且不同物种AOX蛋白均含有AOX家族特有的“EXXH”、“EEE-Y”铁离子结合保守结构域，6个保守的组氨酸残基可能参与铁离子的结合，1个保守丝氨酸残基则与二硫键形成有关，因此，推测克隆出的LcAOX1a、LcAOX1b、LcAOX2基因作为双铁羧酸超基因家族成员，有着结合铁离子活性。

2.4 鹅掌楸AOX家族基因表达蛋白系统进化分析

从NCBI蛋白质数据库中搜索已发表的拟南芥（NP_188876.1、NP_188875.1、NP_189399.1、NP_201226.2）、水稻（Oryza sativa，O. glaberrima）（BAA28773.1、BAB71945.1）、胡萝卜（Daucus carota var. sativa）（ALI57378.1、ABZ81229.2、ABZ81230.2）、葡萄（Vitis vinifera）（ACI28876.1、NP_001268001.1）、番茄（Lycopersicon esculentum）（NP_001234117.2、NP_001309890.1）、大豆（Glycine max）（KHN42869.1、KHN39226.1）、西瓜（Citrullus lanatus）（ADD84880.1）

等19个AOX家族同源蛋白，利用MEGA5.0软件将3个鹅掌楸AOX蛋白与数据库检索的蛋白序列进行多重序列比对，并用极大似然法构建系统进化树（图3），AOX蛋白明显分为两大支，即AOX1和AOX2，从亲缘关系来看，LcAOX1a和LcAOX1b

聚为一个小的分支，与胡萝卜DcAOX1蛋白亲缘关系最近;而LcAOX2与胡萝卜DcAOX2a等蛋白亲缘关系较近。因此，该结果一方面说明了鹅掌楸在进化关系上与胡萝卜更为密切，另一方面，也符合AOX家族在AOX1和AOX2亚家族分类事实。

2.5 鹅掌楸AOX家族基因亚细胞定位预测

用TargetP在线软件进行亚细胞定位预测（表2），结果显示LcAOX1a蛋白可能较多分布在除叶绿体、线粒体和分泌通路之外的其他位置;LcAOX2蛋白定位于线粒体，且可信度等级为2，具有较高可信度;LcAOX1b虽然在线粒体中分值最高，但其具体定位信息并不明确。为了使预测结果更加准确，我们使用Wolfpsort在线软件再一次进行LcAOX蛋白亚细胞定位预测（表3），结果显示LcAOX1a蛋白最有可能定位于细胞质区域;LcAOX2蛋白最有可能定位于线粒体中;LcAOX1b蛋白在线粒体和叶绿体中均有定位，其具体定位信息仍需进一步实验验证。

2.6 鹅掌楸AOX家族基因组织表达特性分析

分别提取鹅掌楸的8个组织总RNA，以其反转录cDNA为模板，参考之前已发表的鹅掌楸Actin97作为内参基因（Tu et al.，2019），进行实时定量PCR反应。结果显示（图4），三个AOX基因在花器官中表达量均明显高于其在营养器官中的表達量。其中鹅掌楸AOX1a在雄蕊中表达量极高，其次为花瓣，而在茎、叶片、叶芽等组织中表达量极低，仅有1左右;同样，AOX1b基因在雄蕊中表达量最高，约为叶片的2.69倍，茎中表达量最低，只有叶片的0.2倍左右;AOX2基因在花瓣中表达量最高，约为叶片表达量的3倍左右，叶芽中表达量最低。

3 讨论与结论

交替氧化酶为交替呼吸途径末端氧化酶，是由AOX基因控制编码的一类蛋白酶，Rhoads & Mcintosh（1991）在斑龙芋（Sauromatum venosum）中首次克隆出AOX基因并命名为AOX1。随后，国内外学者对交替呼吸途径以及AOX基因进行了大量研究。迄今为止，几乎在所有的高等植物基因组中均检测到AOX基因的存在，而在动物中，只有极少数低等动物如原生生物中含有AOX基因（Mcdonald & Vanlerberghe，2004），此外，在真菌、细菌以及藻类中都有发现（Mcdonald & Vanlerberghe，2006）。AOX基因家族是由核基因编码的一个较小的基因家族，通常被分为两个亚家族AOX1和AOX2（Selinski et al.，2018），多数单子叶植物中往往仅含有AOX1亚家族，但天南星科植物如绿萍、红掌、绿萝等古老的单子叶植物中也检测到AOX2亚家族的存在（Costa et al.，2017），此外，对石头松（Pinus pinea）的研究发现，其含有AOX1和AOX2两个亚家族，可以推断AOX1和AOX2两个亚家族出现在裸子植物与被子植物分离之前的时期，并且证明单子叶植物中也存在AOX2亚家族，可能在之后的进化发展中逐渐丢失了相关序列（António et al.，2009）;而双子叶植物除了极个别物种如杨树（Populus）外（杨树仅存在AOX1亚家族），均含有两个亚家族（张旭，2014）。拟南芥AOX基因家族分析结果表明，共有5个AOX基因存在拟南芥中，其中有4个AOX1基因分别为AOX1a、AOX1b、AOX1c、AOX1d以及1个AOX2基因（Saisho et al.，1997;Clifton et al.，2005）。对大豆研究发现其存在1个AOX1基因和2个AOX2基因分别为AOX2a和AOX2b（Thirkettle-Watts & Whelan，2003）。Ito et al.（1997）从水稻中分离鉴定出两个AOX基因，分别命名为AOX1a、AOX1b，此后Hiroaki et al.（2002）进一步对水稻研究发现并命名为AOX1c基因，三者均为AOX1亚家族基因。

本研究依据鹅掌楸多组织转录组数据筛选鉴定并克隆3个AOX家族基因LcAOX1a、LcAOX1b、LcAOX2，系统发育分析结果表明鹅掌楸AOX基因同样分化为AOX1与AOX2两个亚家族。

根据“SUM”模型（Siedow & Umbach，1995），AOX蛋白在第一和第四个螺旋分别含有1个保守的 “EXXH”，形成双铁羧酸活性中心，且在C端含有“FXHR”与“EEE-Y”的保守序列。而在此后Andersson & Nordlund（1999）提出的“AN”模型中，AOX在第二和第四个螺旋中含有“EXXH”保守序列，且活性中心仅位于第四个螺旋。本研究进行蛋白同源性分析发现鹅掌楸AOX家族3个基因均含有AOX家族特有的“EXXH”“FXHR”“EEE-Y”等铁离子结合的保守结构域，尤其在C端保守性极高。亚细胞定位预测结果显示LcAOX1a蛋白可能分布在除线粒体、叶绿体和分泌通路之外的其他位置;LcAOX1b在叶绿体和线粒体中均有定位;LcAOX2蛋白定位于线粒体，这与之前报道的对拟南芥AOX2基因进行亚细胞定位实验的结果一致，并且该研究发现AOX2基因在拟南芥萌发初期的交替呼吸途径中发挥重要作用（Saisho et al.，2001）。

組织表达分析结果表明鹅掌楸LcAOX1a、LcAOX1b与LcAOX2基因均在生殖器官中表达量较高，其中LcAOX1a与LcAOX1b基因均在雄蕊中表达量最高，特别是LcAOX1a基因在雄蕊中表达量远远高于其他组织。AOX基因作为重要的线粒体末端氧化酶，在能量溢流和热能转化过程中具有重要的作用，然而在开花传粉期间，可能由于花器官需要热量维持活跃的代谢反应，因此表现出AOX活性的显著增强（Meeuse，1975）。LcAOX1a基因在雄蕊中特异性表达，雄蕊表达量是叶片的2万倍以上，推测该基因除了与非生物胁迫相关之外，可能与雄蕊发育密切相关。与此结果相似，在对大豆、棉花（Gossypium spp.）和拟南芥研究中发现AOX1基因均表现出雄蕊特异性表达，且AOX1基因的雄蕊特异性表达模式与细胞质雄性不育有着密切的关系（Shin et al.，2002;Li et al.，2013）。此外，对苏铁产热机制研究表明，雄球果产热明显高于雌球果，而独特的线粒体形态和CrAOX1介导的小孢子呼吸可能在球果产热中发挥重要作用（Yasuko et al.，2019）。也有一些研究表明AOX1基因的表达并不引起细胞质的雄性不育，而是与小孢子母细胞发育相关（Johns et al.，1993）。而LcAOX2基因同样在生殖器官中表达量更高，其中花瓣中表达量最高，其次为花萼和雌蕊。在西瓜和芒果的研究中发现AOX2在果实发育过程中有大量表达，推断AOX2可能与果实发育相关（Considine，2001;李严曼，2011）。拟南芥研究中发现AOX2在成熟的种子中表达量最高（Nakabayashi et al.，2005）。因此推测AOX2可能与植物生长发育密切相关。在对本研究通过对鹅掌楸AOX基因序列克隆并探讨其组织表达模式与功能之间的潜在关系，以期为今后进一步开展AOX家族基因生物学功能研究提供参考。

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