利用E.coli评价铁碳微电解处理印染废水的生物毒性变化

2020-08-19贾艳萍张真佟泽为王嵬张兰河

化工学报 2020年8期

贾艳萍，张真，佟泽为，王嵬，张兰河

（1 东北电力大学化学工程学院，吉林省吉林市132012； 2 长春工程学院能源动力工程学院，吉林长春130012）

引言

纺织工业每年产生约2.2×109t 的废水，其中约80%为印染废水[1-6]。随着新型染料、助剂的应用，印染废水成分日趋复杂，处理难度不断加大，亟需开发工艺简单、运行费用低的印染废水处理工艺。铁碳微电解工艺是将铁屑与活性炭浸没于废水中，利用铁屑内部和铁碳之间的电位差形成电池，产生微型电解电路与废水中的污染物发生反应，提高废水可生化性，这种工艺流程简单、管理方便、运行成本低[7-12]。许多学者利用铁碳微电解工艺处理印染废水，污染物去除率较高。例如，Edison 等[13]采用零价铁结合石墨工艺处理印染废水，当进水pH为3.5、零价铁投加量为3.5 g/L 时，色度、COD 和TOC 去除率分别为100%、67%和59%。Xingu-Contreras 等[14]采用沸石负载纳米铁工艺处理甲基橙废水，当纳米铁与沸石比为0.06∶1、反应时间为16 h时，甲基橙去除率80%。王悦[15]采用铁碳微电解工艺处理印染废水，当进水pH 为3，气水比为3∶1，铁碳填料投加量为600 g/L 时，COD 去除率最高为67%。张禾[16]采用铁碳微电解-Fenton 组合工艺处理印染废水，进水pH 为4，铁投加量为25 g/L，铁碳质量比为1∶2，H2O2投加量为130 mg/L，COD 去除率可达80%。这些研究主要探讨了运行工艺参数对污染物去除率的影响，尚不明晰铁碳微电解工艺处理前后印染废水生物毒性的变化。本课题组[17]前期研究发现，与进水相比，铁碳微电解工艺出水的乳酸脱氢酶（LDH）和活性氧物质（ROS）含量分别下降77%及25%，细胞膜破损率及死亡率降低，对数生长期延长，初步证明了铁碳微电解工艺影响印染废水的可生化性和生物毒性。E.coli是生态系统的重要组成部分，具有生长繁殖快、生物机体小、种群数量大、保存方便等优点，它与高等动物有相似的物理化学特性及酶作用过程[18]。通过分析有毒污染物对E.coli 生物转运和转化的影响，可以反映微生物新陈代谢过程中物质、能量传递与生物群落的变化[19]。目前，尚缺乏利用E.coli 生物学指标的变化评价印染废水生物毒性的系统研究。

本研究采用铁碳微电解工艺处理实际印染废水，利用E.coli 的形态、抗氧化酶系统、生物标志物等的变化，分析实际印染废水经铁碳微电解工艺处理前后的生物毒性变化，从而为实际印染废水中的污染物达标排放提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

预处理实验、实验装置见课题组前期发表文章[17,20]。

1.2 实验用水

利用E.coli 分析对照组、进水组和出水组生物毒性的变化，对照组采用超纯水配制LB 培养基，实验组分别采用铁碳微电解工艺的进水、出水配制LB培养基，其中铁碳微电解工艺的进、出水组的水质指标如表1所示。

表1 进、出水组的水质指标Table 1 Water quality index of influent and effluent

1.3 分析项目和检测方法

pH 采用pH 计（pHSJ-3F 型，上海仪电科学仪器有限公司）测定；COD、氨氮、色度及浊度采用紫外可见智能型多参数水质测定仪（LH-3BA 型，兰州连华环保科技有限公司）测定；TOC 采用总有机碳分析仪（liqui TOC Ⅱ型，德国Elementar 公司）测定；BOD5采用BOD 测定仪（M7-50A型，兰州连华环保科技有限公司）测定[21]；采用紫外-可见分光光度计（UV1700 型，上海奥析科学仪器有限公司）测定MDA、GSH、SOD、CAT及T-AOC[22]。

扫描电子显微镜（SEM）观察采用场发射环境扫描电子显微镜（XL-30 ESEM FEG 型，美国FEI 公司），分析细胞的形态变化[23]。将超纯水、铁碳微电解工艺的进水和出水分别作为对照组、进水组和出水组。将水样8000 r/min 离心15 min，使E.coli 的菌体沉降为菌团，弃上清液；然后加入2.5%戊二醛溶液，振荡菌体，使之均匀分散，置于4℃环境固定2 h，8000 r/min 离心1 min 后弃上清液，采用0.2 mol/L PBS 溶液洗涤3 次；依次加入30%、50%、70%、80%、90%的乙醇，静置15 min，8000 r/min 离心1 min，加入100%乙醇脱水2 次，静置15 min，8000 r/min 离心1 min；将样品置于30℃烘箱内干燥；将样品粘于样品台上喷镀金属膜，置于样品架上观察细胞的形态变化。

采用N800-M生物显微镜（DFM55型，宁波永新光学股份有限公司）观察吖啶橙荧光强度[24]。配制0.01 g/ml 吖啶橙溶液，加入LB 培养基稀释为10-3、10-4、10-5，取E.coli 菌液1 ml 加入到1 L 的LB 培养基中，37℃水浴恒温振荡培养过夜，采用荧光显微镜观察吖啶橙荧光强度。

E.coli 存活率采用台盼蓝拒染法分析[25]。接种处于对数生长期的E.coli，培养24 h，利用台盼蓝进行染色，采用光学显微镜（XSP-BM13C型，上海光学仪器厂）观察，计算细胞存活率。

采用血糖仪（GA-3 型，长沙三诺生物传感股份有限公司）测定葡萄糖含量[26]。将对照组、进水组和出水组制成1 ml的LB培养基，接种处于对数生长期的E.coli，加入0.1 ml 葡萄糖，30℃培养，9000 r/min离心1 min，取上清液测定葡萄糖浓度，并计算进水组和出水组的葡萄糖消耗量抑制率。

采用等温量热仪（KDHW-800A 型，深圳市万博仪器仪表有限公司）测定热值[27]。将E.coli于37℃培养24 h，以2%接种量分别接种于对照组、进水组和出水组培养基中，取5 ml 接种过的培养基加入到25 ml安瓿瓶，测定其热值变化。

采用荧光分光光度计（RF-5301PC 型，日本岛津公司）测定内源荧光蛋白和细胞膜电位。采用核酸蛋白检测仪（HD-3001 型，上海市嘉鹏科技有限公司）测定核酸蛋白含量[28]。将对照组、进水组和出水组分别加入50 μl 菌液，37℃恒温振荡培养，每隔2 h 取样，500 r/min 离心3 min 取上清液，2000 r/min离心5 min 取下层菌体漂洗，稀释至OD600为0.3，取5 ml 菌液，加入250 μl 的罗丹明123，37℃恒温振荡培养30 min，2000 r/min 离心5 min，洗涤，分别于525 nm和340 nm测定荧光发射光谱，测得内源荧光蛋白和细胞膜电位，再将得到的E.coli 菌液，稀释至OD600为0.1，冷冻破碎，测定核酸蛋白含量。

2 结果与分析

根据课题组前期的研究基础[20]，铁碳微电解工艺处理印染废水的优化条件为：初始pH 为4、铁投加量为80 g/L、铁/碳质量比为0.8、反应时间为90 min 时，COD、浊度、色度、氨氮及TOC 去除率达到最高，分别为75.48%、87.88%、75.34%、92.01% 及81.09%。在最优工艺条件下进行E.coli 生物毒性实验。

2.1 细胞形态分析

将超纯水作为对照，在对照组、进水组和出水组中分别接种等量的E.coli，采用SEM 分析E.coli 表面形态的变化，结果如图1(a)所示。由图1(a)可知，对照组中的E.coli 呈钝圆杆状，细胞饱满，细胞壁紧密，表面光滑，轮廓清晰，形态完整，细胞之间存在大量发丝状细线连接的菌毛，加强了菌体间的机械结合力，有助于致密生物膜形成和电子传递[29]。进水组中的E.coli 呈破碎状态，出现明显的损伤性褶皱及孔洞，细胞两端严重皱缩，毒性强的进水破坏了细胞壁和细胞膜的双重屏障，胞内物质泄漏，细胞坏死；出水组中的E.coli 大部分为正常形态，表面略出现褶皱，可维持正常生命代谢活动。

吖啶橙是一类碱性荧光染色剂，具有价格低廉、可多次染色观察及荧光强度大等优点。吖啶橙可以透过细胞膜进入细胞内，当吖啶橙进入坏死细胞后，细胞呈橘红色，可以根据荧光颜色的变化反映细胞的状态[30-31]。采用吖啶橙标记的E.coli，如图1(b)所示。对照组中荧光极少，即细胞基本无死亡；出水组中荧光较少，即细胞死亡较少，说明铁碳微电解工艺具有降低印染废水生物毒性的作用；进水组中荧光极多，死亡细胞发出荧光，细胞边界不清，已解体或接近解体，说明未经处理的印染废水毒性极强。

图1 E.coli的微观结构Fig.1 Microstructure image of E.coli

2.2 抗氧化系统分析

2.2.1 MDA 和GSH 含量 E.coli在有毒废水中会产生高浓度的氧自由基，可攻击细胞膜中的多不饱和脂肪酸，最终产物是MDA。MDA 可与硫代巴比妥酸发生反应，生成红棕色的3,5,5-三甲基唑-2,4-二酮，该化合物在532 nm 处有最大吸收峰，吸收峰强度的变化可反映MDA 含量变化程度[32]。E.coli 在对照组、进水组及出水组中的MDA 含量如图2(a)所示。由图2(a)可知，对照组中MDA 含量无明显变化，细胞处于正常生理代谢状态。进水组中MDA含量急剧上升，说明印染废水中有毒污染物含量高，大量污染物附着在细胞表面并与细胞上的不饱和脂肪酸反应，生成含有醛基、羟基和酮基等过氧化物，使细胞发生脂质过氧化反应并产生氧化损伤，因此产生大量MDA，MDA 可导致蛋白质、核酸等交联聚合，影响膜系统的稳定性及流动性，其含量可反映过氧化水平，与细胞防御机制破坏程度呈正相关；后期MDA含量略有下降，细胞功能受损，与脂质过氧化作用有关的酶类被分解。出水组中MDA 含量明显下降，铁碳微电解工艺去除了部分有毒污染物，降低了E.coli的氧化损伤及死亡率。

图2 MDA和GSH含量Fig.2 Content of MDA and GSH

GSH 可催化去除H2O2、超氧阴离子自由基（·）等，降低细胞氧化损伤程度[33-34]。E.coli 在对照组、进水组及出水组中的GSH含量如图2(b)所示。由图2(b)可知，出水组中GSH含量降低，这说明通过铁碳微电解工艺，细胞中含巯基的酶处于较高的稳态，避免血红蛋白被氧自由基破坏；然而进水组中GSH 含量最高，进水污染物引起细胞的H2O2、O-2·含量升高；还原型GSH 可与5,5'-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)反应，生成谷胱甘肽二硫化物(GSSG)和黄色的2-硝基-5-巯基苯甲酸，GHS 含量与被氧化程度呈负相关。

2.2.2 抗氧化酶活性分析 SOD 属于抗氧化酶系统，在细胞内的活性高低可反映生物的衰老与死亡程度。SOD 活性变化可反映细胞清除氧自由基的能力。E.coli 在对照组、进水组及出水组中的SOD活性变化如图3(a)所示。由图3(a)可知，对照组中SOD 活性保持稳定，出水组SOD 活性居中，经过铁碳微电解工艺处理后的印染废水生物毒性在一定程度上降低。而进水组中SOD 活性先是急剧上升，在有毒有害环境的胁迫下，细胞短时间之内即可作出相应的应激机制，快速合成大量SOD；SOD可清除细胞内的·、羟基自由基（HO·）及氢过氧自由基（HOO·）等，并将其歧化为H2O2和O2，即：+2H+H2O2+ O2。降低细胞内的氧自由基含量，特定抑制·的产生，对细胞的氧化及抗氧化平衡存在重要作用[35-36]。随着时间的延长，活性氧活性升高，SOD 活性逐渐降低，细胞结构被破坏，SOD的氨基酸残基被·OH 或H2O2氧化，产生羰基，影响细胞正常生理功能[37]。

CAT 是一种含巯基的抗氧化酶，可与谷胱甘肽过氧化物酶协同清除H2O2，减少或阻止·OH 的产生，此外可与SOD 协同降低细胞的氧化损伤[38-39]。E.coli 在对照组、进水组及出水组中的CAT 活性变化如图3(b)所示。对照组中CAT 活性波动较小。进、出水组中CAT 活性呈先升高后降低的趋势，这表明E.coli 在受到有毒污染物刺激后，首先产生一定的应激反应，激活CAT 活性来对抗应激反应导致的自由基增加。但是，随着反应时间的延长，CAT活力受到抑制，从而降低了机体清除自由基和抗氧化损伤的能力[40]。CAT与SOD 活性变化趋势基本保持一致，这也反映了在抗氧化反应中两者协同氧化分解活性基团（ROS）的关系，这与张晶[41]的研究结论相似，其研究结果表明：SOD 和CAT 活力变化趋势相近且联合分解ROS。

细胞的抗氧化力与细胞生理状态高度相关，分为以微量元素为活动中心的酶促体系和氨基酸、维生素、金属蛋白质组成的非酶促体系，T-AOC 是评价细胞总抗氧化能力的标志物。E.coli在对照组、进水组及出水组中的T-AOC 活性变化如图3(c)所示。由图3(c)可知，对照组中T-AOC 活性无显著变化。进水组、出水组的T-AOC 均出现先升高后降低的现象，这说明有毒污染物可以通过影响E.coli 的抗氧化能力而产生毒性效应。铁碳微电解工艺通过降解污染物、减弱细胞膜受损程度及减少脂质过氧化物的产生来降低细胞损伤，主要包括3条途径：①消除活性氧、自由基，降低脂质过氧化发生概率；②通过分解过氧化物阻断过氧化链；③去除催化过程中的金属离子[42-43]。

图3 抗氧化酶活性对比Fig.3 Comparison of antioxidant enzyme activity

2.3 生物标志物分析

2.3.1 E.coli 存活率和跨膜电位分析台盼蓝可与丧失活性或细胞膜不完整的细胞中的DNA 进行结合，将细胞染成蓝色，而正常活细胞可排斥台盼蓝将其染色，因此在显微镜下可以快速、简便的计数细胞的存活率。对照组、进水组及出水组E.coli 存活率的变化见图4(a)。由图4(a)可知，对照组、进水组及出水组的存活率约为89%、23%及61%，铁碳微电解工艺能高效地分解酯类、醇类等污染物，将其转化为易生化处理的小分子污染物，通过降低印染废水中污染物的毒性，来减弱对细胞的膜系统及整体状态的损害，提高细胞的存活率[20]。

E.coli细胞膜的内外电势存在跨膜电位，罗丹明123 作为阳离子亲脂性荧光染料可透过细胞膜，与细胞内膜特异性结合。罗丹明123的最大发射波长为525 nm，因此通过荧光光谱及525 nm处的荧光强度反映细胞膜电位的变化。罗丹明123染色荧光光谱如图4(b)所示。由图4(b)可知，对照组、出水组及进水组的最大荧光强度为103、249、445，且进水组中荧光强度最高，其原因是废水中污染物与细胞表面接触，发生反应使细胞膜受损或使细胞代谢紊乱死亡，细胞内容物流出，导致膜电位较高，这与万嫦玉[28]的研究结论相似，其研究结果表明：实验组较对照组的细胞膜电位有较大提升，其原因是细胞膜受损，溶出的Zn2+进入细胞，导致细胞膜电位上升。

图4 E.coli存活率和罗丹明123染色荧光光谱Fig.4 E.coli survival rate and rhodamine 123 staining fluorescence spectrum

2.3.2 核酸蛋白含量和内源荧光蛋白分析 E.coli

为原核生物，拟核及细胞膜上存在少量具有转运、孔道及调控膜通透性的蛋白质等，与细胞生命活动密切相关，因此通过测定核酸、蛋白质含量变化，可反映细胞的完整程度。细胞的核酸蛋白含量见图5(a)。由图5(a)可知，由于铁碳微电解工艺降解了大部分有毒污染物，与进水组相比，出水组核酸含量升高、蛋白质含量降低；进水组中污染物引起细胞核酸损伤，导致核酸含量降低，同时污染物与蛋白质发生反应，使其空间结构发生变化，导致其变性失活，蛋白质含量升高[44]。由于核酸、蛋白质是细胞生长代谢的关键物质，因此废水中有毒污染物导致细胞的物质合成能量代谢受损。

E.coli细胞内存在大量蛋白质，部分蛋白质含有可发射荧光的氨基酸即称内源荧光，例如色氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸等，在270～340 nm 间存在荧光吸收情况，在约340 nm 处存在最高荧光发射峰[45]。内源荧光蛋白荧光光谱如图5(b)所示。由图5(b)可知，对照组、出水组及进水组的最大荧光强度为719、526、247，且对照组及出水组中荧光光谱趋势一致，进水组中荧光强度最弱，其原因可能是污染物进入细胞，与蛋白质中的氨基（—NH2）、巯基（—SH）发生反应，使得蛋白质空间结构发生变化甚至变性失活，导致其荧光特性减弱[46]。

图5 核酸蛋白含量和内源荧光蛋白荧光光谱Fig.5 Nucleic acid protein content and endogenous fluorescent protein fluorescence spectrum

2.3.3 葡萄糖消耗量和热值测定葡萄糖是E.coli的主要营养物质，当暴露于有毒污染物时，细胞代谢会受到严重影响，此时葡萄糖消耗量会降低。采用血糖仪检测培养液中的葡萄糖消耗量，得出对照组＜出水组＜进水组，与对照组相比，进水组与出水组葡萄糖消耗量抑制率分别为85%和47%。E.coli细胞表面带负电荷，可与带正电荷的污染物发生吸附作用，使细胞膜的黏滞性发生改变，导致细胞膜通透性和物质运输交换速率发生改变，对细胞生长产生抑制作用。这与Fang 等[47]的研究结论相似，其研究结果表明：根据E.coli 的葡萄糖消耗量可准确评估其急性生物毒性，对照组中E.coli 消耗大量葡萄糖，而存在重金属的实验组中，E.coli代谢紊乱、葡萄糖消耗量降低。

采用等温量热法检测细胞的热值变化，37℃时E.coli 的代谢产热曲线如图6 所示。由图6 可知，E.coli 发生分解、合成及其他反应的生长代谢过程中，热量发生变化。活细胞的热量释放值远大于吸收值，当处于有毒有害环境中时，可影响细胞的生长。E.coli达到放热峰值之前处于对数生长期，细胞快速生长繁殖。对照组、出水组和进水组中代谢产热曲线的变化规律相似，即均呈先升高后降低的趋势，进水组和出水组热值分别为对照组的71.20%和86.83%。因此进水组中的细胞生长最为缓慢，有毒污染物对E.coli 的代谢存在抑制作用，导致其产热减弱，出现停滞期延长、生长峰后移及最大发热功率降低的现象。