刘生财,李汉生,杨曦晨,赖钟雄

(福建农林大学 园艺植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

龙眼(DimocarpuslonganLour.)又名桂圆，属于无患子科(Sapindaceae)龙眼属(Dimocarpus)，富含类黄酮等次生代谢物质，具有重要的营养价值和药用价值[1-3]。类黄酮广泛存在于植物体内，如菊花[3]、大豆[4]、山楂叶[5]等，其合成受到多种因素的影响，如温度、光照、伤害等，类黄酮的生物合成已经成为植物次生代谢基因工程、代谢工程的主要目标。表儿茶素是类黄酮化合物中重要一种类型，具有较强的抗氧化能力，营养价值和药用价值更高[6-7]。

光是植物的生长发育及次生代谢产物形成的重要影响因子[8-10]。在单色光处理中，蓝光有利于银杏叶片[9]、迷迭香[11]和龙眼胚性愈伤组织[12]中类黄酮含量的积累。红光和蓝光是植物吸收的主要光源，有利于促进次生代谢产物的合成与累积，红蓝复合光更有利于次生代谢产物的累积，能够改善茄皮品质并促进类黄酮合成[13]，提高韭菜类黄酮含量[14]。

植物体内类黄酮的生物合成是一系列酶促反应过程。查尔酮合成酶(CHS)是类黄酮物质生物合成途径的关键酶，介导黄酮类化合物合成的第1步[15-16]。无色花色素还原酶基因(LAR)是类黄酮生物合成途径中下游的一个重要基因，LAR蛋白能够催化儿茶素、无色花青素和相关的黄烷-3-羟基阿福豆素与没食子儿茶素等植物聚合型原花青素或者浓缩单宁合成起始物质的合成。研究已证实，CHS和LAR基因表达都受到光调控[17-18]。

HY5是第1个被发现促进光形态建成的转录因子,它能编码1个bZIP类型的转录因子[19]。AKIFUMI等[20]研究表明,葡萄HY5的表达受光诱导。冀晓昊等[21]研究发现，HY5不仅参与葡萄果树发育进程，还与花青苷的积累成正相关。HY5诱导拟南芥花青苷合成转录因子MYB75/PAP1[22]和葡萄VvMYBA1[21]的表达，调控花青苷合成途径结构基因表达，导致花青苷积累的差异。而且有研究发现，COP1可泛素化降解HY5进而影响CHS转录[23-24]。光质调控龙眼胚性愈伤组织类黄酮的研究虽有报道[12]，但红蓝复合光对龙眼胚性愈伤组织的研究尚未见报道。因此，探讨不同红蓝复合光配比对龙眼胚性愈伤组织生长状态及类黄酮代谢产物含量的影响，分析转录因子DlHY5及其与类黄酮结构基因DlCHS、DlLAR之间的联系，为揭示红蓝复合光调控龙眼胚性愈伤组织类黄酮代谢的机制提供线索。

1 材料和方法

1.1 植物材料和光照处理

龙眼胚性愈伤组织为福建农林大学园艺植物生物工程研究所长期继代保存的红核子龙眼胚性愈伤组织LC2细胞系[25]。取大小相一致的龙眼胚性愈伤组织接种于MS+2,4-D 1.0 mg/L培养基中。然后将相同接种量的龙眼胚性愈伤组织置于光照培养箱内，设计9种红蓝复合光配比，分别为红∶蓝=1∶9、红∶蓝=2∶8、红∶蓝=3∶7、红∶蓝=4∶6、红∶蓝=5∶5、红∶蓝=6∶4、红∶蓝=7∶3、红∶蓝=8∶2、红∶蓝=9∶1。光照总强度为32 μmol/(m2·s)，光照时间为12 h/d，蓝光中心波长为457 nm，红光中心波长为660 nm。以黑暗条件作为对照。研究不同光照条件对龙眼胚性愈伤组织生长的影响。通过倒置电子显微镜(Leica)进行龙眼胚性愈伤组织细胞观察。每个处理25瓶，处理周期为25 d。每个处理设3次生物学重复。

1.2 胚性愈伤组织生长率测定

取出龙眼胚性愈伤组织测定鲜质量，计算其生长率[26]，生长率=(终鲜质量-接种鲜质量)/接种鲜质量×100%。

1.3 类黄酮含量测定

黄类酮提取方法参照李琨等[27]的方法并适当改良。将龙眼胚性愈伤组织进行冻干处理2 d，天平称取0.2 g材料，首先加入60%乙醇溶液10 mL，通过超声波清洗器(KQ-200SPDE)提取1 h(60 ℃，功率300 W)，冷却静置20 min，再通过离心机(TGL-15B)离心10 min(8 000×g，20 ℃)。然后吸取5 mL上清液于新试管中，并稀释至10 mL。最后取龙眼胚性愈伤组织提取液5 mL，精确加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀后放置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀后放置 6 min，加入4 mL 20%氢氧化钠溶液，加入10 mL 60%乙醇溶液定容至10 mL刻度线，摇动均匀并静置15 min。通过紫外可见分光光度计(T6)检测吸光度，波长设置为510 nm，根据所建立标准曲线计算龙眼胚性愈伤组织的类黄酮含量。

1.4 表儿茶素提取和UPLC分析

龙眼胚性愈伤组织表儿茶素的提取方法参照类黄酮提取方法。然后利用旋转蒸发仪将提取液蒸干，再用5 mL甲醇溶液溶解。最后，将提取液通过0.22 μm有机膜，待上机测定。色谱条件[28]：Waters ACQUITY HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm) 色谱柱;流动相为甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B)，梯度洗脱(0～12 min，5%～20%A;12～30 min，25%～55%A);流速:0.2 mL/min;检测波长:280 nm;柱温:30 ℃;进样体积:1 μL。

1.5 红蓝复合光配比对龙眼胚性愈伤组织中DlLAR、DlCHS、DlHY5基因表达影响试验

根据龙眼基因组数据库及转录组信息，筛选DIHY5、DlCHS、DlLAR基因序列。取不同光照处理后的龙眼胚性愈伤组织总RNA，RNA质量检验合格后采用PrimeScript® RT reagent Kit(TaKaRa)试剂盒进行cDNA逆转。参照LIN等[29]方法，以龙眼EIF4a、EF-la和FSD作为内参基因，采用罗氏LightCyclers 480和SYBR Prumix EXTaqTM Ⅱ进行不同光照处理下HY5、DlCHS、DlLAR基因qPCR分析。龙眼基因qPCR引物信息见表1。

表1 龙眼基因qPCR引物信息Tab.1 Primers for qPCR of longan

1.6 数据分析

试验数据统计分析使用SPSS V19.0 软件，单因素方差分析采用Duncan法，显著性水平设为P<0.05。制图采用GraphPad Prism 6.0软件。

2 结果与分析

2.1 红蓝复合光配比对龙眼胚性愈伤组织生长的影响

通过对龙眼胚性愈伤组织形态进行观察，与黑暗相比，红蓝复合光配比为1∶9和2∶8时，龙眼胚性愈伤组织生长量较多，生长率分别为1 107.5%、1 130.0%；红蓝复合光配比为9∶1和8∶2时，龙眼胚性愈伤组织生长量较少，生长率分别为877.5%和912.5%(图1)。

不同小写字母表示各处理差异在0.05水平显著，下同Different small letters indicate significant differences at 0.05 level，the same below图1 红蓝复合光配比对龙眼胚性愈伤组织生长率的影响Fig.1 Effect of the ratio of red-blue composite light on growth rate of longan embryonic callus(ECs)

通过对愈伤组织形态观察(图2A—D)也可以看出，蓝光比例高时有利于愈伤组织增殖，而且颜色有些褐色，当红蓝光配比为9∶1时，愈伤组织呈淡黄色。而对龙眼胚性愈伤组织显微观察时，并未发现红蓝复合光对其有明显影响，但红蓝复合光配比为1∶9时，细胞中的内含物质更多，颜色更深(图2E—H)。

A和E：黑暗；B和F：红∶蓝=1∶9；C和G：红∶蓝=5∶5；D和H：红∶蓝=9∶1

2.2 红蓝复合光配比对龙眼胚性愈伤组织类黄酮和表儿茶素含量的影响

由图3可知，红蓝复合光配比对龙眼胚性愈伤组织类黄酮及表儿茶素含量有显著影响。当红蓝复合光配比为1∶9时，类黄酮及表儿茶素含量均为最高，分别为12.49 mg/g和2 187.54 μg/g，显著高于其他处理；随着复合光中红光比例的增加，龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和表儿茶素含量都呈下降趋势。其中，在红蓝光配比为7∶3、8∶2和9∶1时，类黄酮含量较低，为8.38～8.73 mg/g，与黑暗处理(8.31 mg/g)差异不显著；而在黑暗条件下表儿茶素含量最低。当红蓝光进行配比时，蓝光对总黄酮和表儿茶素的积累效率显著大于红光，随着红蓝复合光中红光比例的增加，类黄酮和表儿茶素含量逐渐降低；随着蓝光比例的增加，类黄酮和表儿茶素总含量逐渐增加。表明红蓝光配比中蓝光比例高时有利于类黄酮及表儿茶素累积。

图3 红蓝复合光配比对龙眼胚性愈伤组织类黄酮和表儿茶素含量的影响Fig.3 Effect of the ratio of red-blue composite light on the contents of flavonoids and epicatechin of longan ECs

2.3 红蓝光复合配比对龙眼DlCHS、DlLAR和DlHY5基因表达的影响

通过对龙眼胚性愈伤组织类黄酮合成关键基因DlCHS和DlLAR在红蓝光配比中的表达量分析，DlCHS和DlLAR相对表达量变化趋势一致(图4a—b)。在黑暗培养时，DlCHS和DlLAR的相对表达量都是最低。随着红蓝复合光配比变化，DlCHS和DlLAR基因相对表达量也发生显著变化。随着红光比例降低，DlCHS和DlLAR基因相对表达量呈先上升后下降趋势，在红蓝光配比为3∶7时，DlCHS和DlLAR相对表达量最高。而且，还可以看出，有光存在时DlCHS和DlLAR基因相对表达量均显著高于对照，说明红蓝光配比可以影响龙眼胚性愈伤组织类黄酮代谢产物合成。

同时，DlHY5的相对表达量在黑暗培养条件下最低(图4c)。当复合光配比为红∶蓝=1∶9时，DlHY5的相对表达量达到最高值，其他复合光配比处理的相对表达量均低于红∶蓝=1∶9处理，但是也高于黑暗处理。可知红蓝复合光比黑暗条件更适合转录因子DlHY5的表达。同时，还发现DlHY5基因的表达量趋势与类黄酮代谢产物含量趋势基本一致。因此，推测红蓝复合光可能通过调控DlHY5基因表达量进而影响类黄酮代谢产物的合成。

图4 红蓝复合光配比对DlCHS、DlLAR和DlHY5基因表达的影响Fig.4 Effect of the ratio of red-blue composite light on the expression levels of DlCHS，DlLAR and DlHY5 of longan ECs

3 结论与讨论

3.1 红蓝复合光有利于龙眼胚性愈伤组织生长及类黄酮和表儿茶素积累

光质是调节控制植物生长及代谢的基本因素之一，可以调控大多数生物合成过程，不仅影响植物的初生代谢和生长状态，也会影响植物的次生代谢过程。红蓝复合光有利于次生代谢产物的累积，能够改善茄皮品质并促进类黄酮合成[13]，提高韭菜类黄酮含量[14]。不同蓝光和红光配比能显著地影响樱桃番茄果实的品质，蓝光比例增大可促进樱桃番茄果实番茄红素、游离氨基酸和类黄酮的形成，增加糖酸比；红光比例增大有利于可滴定酸的形成[30]。本研究也得到相似结论，红蓝复合光有利于龙眼胚性愈伤组织中类黄酮及表儿茶素合成，且蓝光比例越大越有利于次生代谢物质的合成。

3.2 红蓝复合光对龙眼胚性愈伤组织类黄酮合成基因的影响

CHS是类黄酮物质生物合成途径的关键酶。它介导了黄酮类化合物合成的第1步，并且具有功能多样性，参与不同发育阶段、组织特异性和环境响应等方面调控，对类黄酮的合成起到极为关键的作用，不但对调控植物体内黄酮类化合物的生物合成具有重要意义，还对提高植物体内类黄酮物质的产量具有非常重要的意义。CHS基因的表达受到多种因素的影响，如环境胁迫、光照、伤害、诱导剂，甚至中间产物如肉桂酸，这些都能影响CHS的表达水平；CHS和苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的表达量降低，糖和表儿茶素含量下降[31]。对拟南芥、芥菜、欧芹等植物研究表明，CHS启动子含有光响应元件ACE(ACGT containing element)和MRE(MYB recognition element)，受紫外光和蓝光诱导表达[32-33]。

CHS基因在柑橘类黄酮生物合成中具有非常关键的作用，CHS基因的表达水平与类黄酮含量之间表现出很明显的正相关关系[34]，表明CHS基因的表达水平与类黄酮含量是十分密切的。LAR基因对于表儿茶素的调控极为重要，在龙眼胚性愈伤组织中能对表儿茶素物质进行催化、转化，对表儿茶素含量起到极大的促进作用，对表儿茶素的合成至关重要。LAR蛋白能够催化儿茶素、无色花青素和相关的黄烷-3-羟基阿福豆素与没食子儿茶素这些植物聚合型原花青素或者浓缩单宁合成起始物质的合成。本研究也发现，DlCHS基因和DlLAR基因受到红蓝复合光的影响，红光在一定程度上会抑制相关基因的表达，随着蓝光在红蓝复合光中所占比例的增加，类黄酮和表儿茶素含量也提高，这说明蓝光会对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和表儿茶素合成基因的表达起到促进作用，有利于类黄酮合成。

3.3 转录因子HY5参与红蓝复合光对龙眼胚性愈伤组织类黄酮代谢的调控

不同波长的光被植物体内不同光受体感知，并通过光信号途径调控植物生长发育和次生物质代谢。HY5能够受到光质诱导表达。李慧峰等[35]研究表明，苹果HY5能够被白光、蓝光、紫外光诱导，而红光对HY5表达没有明显诱导。冀晓昊等[21]研究还发现，HY5在葡萄果实发育过程中有2次表达高峰，分别在花青苷快速积累期与果实成熟后期，说明HY5的表达还与发育进程有关，且与花青苷的积累呈正相关。已有研究表明，HY5可以诱导拟南芥花青苷合成转录因子MYB75/PAP1的表达[22]。VvMYBA1是拟南芥MYB75/PAP1的同源基因，其表达规律与VvHY5基本一致，说明红蓝复合光可能是通过光信号转录因子VvHY5调控VvMYBA1的表达，进而调控花青苷合成途径结构基因的表达，导致花青苷积累的差异。而在本研究中也发现，随着红光在红蓝复合光中比例的增加，DlHY5表达也受到抑制，这就表明红蓝复合光能够诱导龙眼胚性愈伤组织中DLHY5基因表达，进而影响类黄酮代谢产物的合成。