游敏芳，吴 磊，廖朝美，张依裕，刘若余，谭光辉，李杰章

(1.贵州大学 高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025； 2.贵州大学 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州 贵阳 550025； 3.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025)

长顺绿壳鸡蛋为贵州省长顺县特产，富含多种维生素，还含有大量脑磷脂、卵磷脂、神经磷脂和多种微量元素，被誉为“鸡蛋中的人参”[1]。但是随着现代规模化、集约化养殖的加速发展，人们把选育的重点放在鸡的生长速度和产蛋数量上，忽略了鸡蛋品质，导致鸡蛋品质呈现下降趋势。鸡蛋的品质与其蛋壳质量息息相关，蛋壳质量的下降给鸡蛋行业造成了巨大的经济损失。DOMINGUEZ等[2]的研究结果表明，蛋壳缺失或部分脱落的鸡蛋很容易受到细菌污染，影响其鸡蛋品质。ITPR1基因是影响Ca2+转运的重要基因，钙是蛋壳的主要组成成分，机体对钙的吸收和利用直接决定了蛋壳的形成与质量[3-4]。因此，为了使贵州地方鸡品种更加特色化和优质化，通过研究影响Ca2+通道相关的基因来改善长顺绿壳蛋鸡的蛋壳品质具有重要意义。RYDR-ITPR是肌醇1，4，5-三磷酸受体(ITPRs)的结构域，此结构域具有影响钙通道活性的功能。蛋白质结构域是实现蛋白质功能的最小结构单位，探索蛋白质结构域所对应的基因序列的单核苷酸突变位点能更精准、有效地挖掘发挥功能的关键位点。ITPRs是细胞内Ca2+释放的重要通道，能够引起细胞内Ca2+信号的启动和发生。ITPRs几乎存在于所有真核细胞的内质网上，在人类、小鼠、果蝇、锥虫等体内对ITPRs均有研究[5-8]。SERYSHEVA等[9]研究发现，ITPRs功能异常会导致Ca2+信号异常，与人类的多种疾病相关，如动脉粥样硬化、心肌肥厚、亨廷顿病、偏头痛、高血压、阿尔茨海默症等。ITPRs有ITPR1、ITPR2和ITPR3等3种亚型，其中ITPR1主要位于内质网上，参与Ca2+转运[10-11]。NAN等[12]研究发现，ITPR1能够维持内质网Ca2+的水平；CASEY等[13]研究发现，ITPR1抑制区的一种新的功能增益突变会导致人类脊髓小脑共济失调，改变Ca2+信号模式；李杰章等[14]研究发现，ITPR1基因的遗传变异能够显著影响三穗鸭的蛋壳品质。近年来，有研究显示，ITPR1对鸭蛋蛋壳品质有显著影响[15]，但ITPR1对长顺绿壳蛋鸡蛋品质的影响尚未见报道。为此，以长顺绿壳蛋鸡为研究对象，在ITPR1基因的RYDR-ITPR结构域寻找SNP位点，研究其多态性对蛋壳质量的影响，以期为进一步探明该基因在长顺绿壳蛋鸡中的生物学功能和育种价值提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试验动物和蛋壳指标

同批出雏、健康无病的70只长顺绿壳蛋鸡饲养于贵州大学动物科学学院农场，在相同饲养环境和同等营养水平下饲养至45周龄后，选择66只健康无病的长顺绿壳蛋鸡，逐只收集并记录其产蛋情况，根据《家禽生产学》[16]中的方法测定蛋形指数、蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋质量、蛋壳质量等蛋壳指标。对66只长顺绿壳蛋鸡进行翅静脉采血1.5 mL，保存于无抗凝剂的生化管中。

1.2 主要试剂和仪器

全血基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖、10×TBE电泳缓冲液、无菌ddH2O均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；2×TaqPCR Master Mix试剂、DL2000 Marker均购自重庆擎科生物科技有限公司。

主要仪器：梯度PCR仪(美国Bio-Rad公司)、电泳仪(北京六一仪器厂)、化学发光荧光全自动分析成像仪(上海山富科学仪器有限公司)、蛋壳强度测定仪和蛋品质分析仪(北京天翔飞域仪器设备有限公司)、核酸浓度检测仪(美国NanoDrop公司)。

1.3 引物合成及PCR扩增

登陆 GenBank 数据库查找鸡ITPR1基因序列(NC_006099.5)，运用在线软件Primer Premier 3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计扩增RYDR-ITPR结构域g.50863—g.51458区域的1对引物，F：5′-CGCATCACCTTTCTCTTTCCC-3′，R：5′-AGGCATTGACTTACTTCGTTTCA-3′，扩增序列长度为596 bp，扩增区域包含部分17内含子、18外显子、18内含子、19外显子和部分19内含子，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR 扩增体系：RNase-free H2O 7 μL，2×TaqPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。反应程序：95 ℃预变性6 min；95 ℃变性40 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；72 ℃终延伸40 s。4 ℃保存。PCR扩增产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检验，纯化后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.4 数据分析

应用生物信息学分析软件DNAStar中的EditSeq、MegAlign程序和Chromas软件，结合人工校对法对测序结果进行比对、查找 SNP 位点，计算其基因型频率、等位基因频率、遗传杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)、多态信息含量(PIC)和χ2值，利用SPSS 18.0软件统计SNP位点与蛋壳品质的关联性。

2 结果与分析

2.1 ITPR1基因RYDR-ITPR结构域SNP位点鉴定

对测序结果进行比对和查找，共发现3个SNP位点，位于18内含子上的g.18853584 G>T和g.18853600 A>G，位于19外显子上的g.18853848 C>T(图1)。3个SNP位点均产生3种基因型，g.18853848 C>T位于CDS区第1 920位，编码氨基酸的密码子由UCU突变为UCC，但没有引起编码丝氨酸的密码子发生改变，属于同义突变。

图1 ITPR1基因RYDR-ITPR结构域SNP位点的序列比对Fig.1 The sequence alignment of the SNP sites of the ITPR1 gene RYDR-ITPR domain

2.2 ITPR1基因RYDR-ITPR结构域SNP位点遗传特性

对长顺绿壳蛋鸡ITPR1基因的测序结果进行分析，结果见表1。由表1可知，g.18853584 G>T的优势基因型为GG，基因型频率为0.485，优势等位基因为G，等位基因频率为0.682，多态信息含量(PIC)为0.340；g.18853600 A>G的优势基因型为AA，基因型频率为0.485，优势等位基因为A，等位基因频率为0.682，PIC为0.340；g.18853848 C>T的优势基因型为CC，基因型频率为0.561，优势等位基因为C，等位基因频率0.720，PIC为0.323，均为中度多态。卡方检验结果表明，3个突变位点均未偏离Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

2.3 ITPR1基因RYDR-ITPR结构域SNP位点的连锁不平衡、单倍型及双倍型分析

对长顺绿壳蛋鸡ITPR1基因的3个SNP位点进行连锁不平衡分析，结果见表2和表3。由表2可知，g.18853584 G>T与g.18853600 A>G的D′值为1.000，且R2值为1.000，说明这2个突变位点完全连锁不平衡； g.18853848 C>T与g.18853584 G>T和g.18853600 A>G之间的D′值均为0.367，且R2值均为0.024，小于0.330，不存在强连锁不平衡。由表3可知，3个SNP位点存在H1、H2、H3和H4等4种单倍型；共检测到H1H1、H1H2、H1H3、H1H4、H2H2、H3H3和H3H4等7种双倍型，其中H1H1频率最高，为0.242；其次是H1H2和H1H3，均为0.197；H3H3频率最低，为0.046。

表2 ITPR1基因RYDR-ITPR结构域SNP位点间连锁不平衡分析Tab.2 Analysis of linkage disequilibrium among SNP sites of the ITPR1 gene RYDR-ITPR domain

表3 ITPR1基因RYDR-ITPR结构域SNP位点的单倍型和双倍型分析Tab.3 Haplotypes and diplotypes analysis of the SNP sites of the ITPR1 gene RYDR-ITPR domain

2.4 ITPR1基因RYDR-ITPR结构域SNP位点与长顺绿壳蛋鸡蛋壳品质的关联性分析

长顺绿壳蛋鸡ITPR1基因3个SNP与蛋壳品质的关联性分析结果见表4。由表4可知，位于19外显子上的g.18853848 C>T突变显著影响蛋壳厚度，其中TT、CC基因型的蛋壳厚度显著高于TC基因型(P<0.05)，位于18内含子上的g.18853584 G>T和g.18853600 A>G突变对蛋壳品质的影响均没有达到显著水平(P>0.05)。

表4 ITPR1基因RYDR-ITPR结构域SNP位点与长顺绿壳蛋鸡蛋壳品质的关联性分析Tab.4 Correlation analysis between SNP sites of the ITPR1 gene RYDR-ITPR domain and eggshell quality in Changshun green-eggshell chicken

3个SNP位点的双倍型与蛋壳品质的关联分析结果见表5。由表5可知，双倍型H3H3个体的蛋壳厚度和强度均显著高于其他双倍型(P<0.05)，其他双倍型各指标间差异均未达到显著水平(P>0.05)，综合各指标，双倍型H3H3个体的蛋壳指标优于其他双倍型。

表5 ITPR1基因RYDR-ITPR结构域SNP位点双倍型与长顺绿壳蛋鸡蛋壳品质的关联性分析Tab.5 Correlation analysis between diplotypes of SNP sites of the ITPR1 gene RYDR-ITPR domain and eggshell quality in Changshun green-eggshell chicken

3 结论与讨论

RYDR-ITPR是IP3Rs钙通道的结构域，此结构域具有影响钙通道活性的功能。本试验在长顺绿壳蛋鸡ITPR1基因RYDR-ITPR结构域中设计1对引物进行SNP检测，发现3个SNP位点，分别是位于18内含子上的g.18853584 G>T和g.18853600 A>G，位于19外显子上的g.18853848 C>T，3个SNP位点均表现为中度多态，表明ITPR1基因在长顺绿壳蛋鸡群体中变异较大，在以后的育种工作中具有较大的研究价值。3个SNP位点均未偏离Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，说明即使在人工选择、迁移和遗传漂变中也存在动态平衡。3个突变位点共产生4种单倍型和7种双倍型，理论上应有10种双倍型。另外3种双倍型没有检测到，可能是因为在自然选择或人工选育过程中被淘汰，也有可能是由于本试验样本数不足导致没有出现另外3种双倍型。

DUAN等[17]研究结果表明，在ITPR1基因的外显子4、44、51、55中找到5个SNP位点，都与蛋壳厚度、蛋壳强度显著相关。本试验在长顺绿壳蛋鸡ITPR1基因的外显子19上有了新的发现，位于外显子19上的g.18853848 C>T突变，但没有引起编码丝氨酸的密码子发生改变，属于同义突变。但SAUNA等[18]研究发现，虽然同义突变并不会改变基因编码氨基酸序列，但是它可以通过影响DNA与调节因子的结合、mRNA稳定性、与核糖开关等相关专一性配体的相互作用等机制，导致mRNA水平和蛋白质水平的表达丰度产生一定差异。LIU等[19]研究结果也表明，同义突变也能通过改变mRNA的稳定性而对蛋白质功能产生重要影响。此外，谭光辉等[20]研究发现，三穗鸭ORAI1基因中3个SNP位点同义突变后，其mRNA二级结构和自由能均发生了改变，其结构的稳定性也会受到影响。本试验中，SNP位点与蛋壳品质的关联性分析结果显示，g.18853848 C>T突变对蛋壳厚度产生了显著影响，另外，此位点的原序列基因型为CC，突变为TT基因型之后对蛋壳厚度的影响均高于CC和TC基因型，这有可能是人为选育或自然选择的结果，表明g.18853848 C>T突变对长顺绿壳鸡蛋的蛋壳品质的影响是正面的，对之后的长顺绿壳蛋鸡选育工作中具有参考价值。WEN等[21]在白来航鸡GALNT1基因的内含子2、ZNF536基因的内含子3中，均发现了与蛋壳质量、蛋壳厚度和蛋壳强度有关的突变位点。本试验结果显示，位于18内含子上的g.18853584 G>T和g.18853600 A>G突变对蛋壳品质没有显著影响，但其对蛋壳厚度、蛋形指数、蛋壳强度、蛋质量和蛋壳质量的影响也是积极的，对绿壳蛋鸡的蛋壳品质也有一定的参考意义。双倍型与蛋壳品质的关联分析结果显示，H3H3双倍型对蛋壳厚度、蛋壳强度都有显著影响，且从关联分析结果可以看出，双倍型对蛋壳品质的影响大于单个SNP位点。谭光辉等[22]在研究ATF4基因多态性与蛋壳品质的关联分析中，也揭示了3个SNP位点共同对蛋壳品质的影响效应大于单个SNP位点。

综上，长顺绿壳蛋鸡ITPR1基因RYDR-ITPR结构域中19外显子上的g.18853848 C>T突变对长顺绿壳蛋鸡的蛋壳品质有显著影响。此外，H3H3双倍型对蛋壳厚度和蛋壳强度均有显著影响，可作为改善蛋壳品质的潜在遗传标记。