猪血凝性脑脊髓炎病毒实时荧光RT-PCR 检测方法的建立与应用

2020-08-07张安洁董雅琴李晓成

中国动物检疫 2020年8期

张慧，张安洁，张锋，尼博，刘爽，崔进，董雅琴，李晓成，魏荣

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.云南农业大学动物医学院，云南昆明 650201）

猪血凝性脑脊髓炎病毒（porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV）属于冠状病毒科β 冠状病毒属，1962 年在加拿大首次被分离到[1]。猪是PHEV 唯一自然易感动物，所有年龄的猪对其均易感，3～4 周龄以下仔猪感染后较易出现临床症状，表现为厌食、呕吐、沉郁、肌肉颤抖等，最后消瘦、死亡，致死率可高达100%[2-3]。血清学调查[3-4]显示，该病的隐性感染在我国及世界各地普遍存在。鉴于目前尚无疫苗可用及基因变异的潜在威胁，该病的病原学诊断非常重要。本研究建立了PHEV 快速、特异、敏感的实时荧光RT-PCR 检测方法，并进行了临床样品检测的初步应用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

超净工作台：美国Forma Scientific 公司；移液器：Eppendorf；涡旋振荡器：美国Scientific Industries 公司；荧光定量PCR 仪：Bio-Rad CFX96 Real-time PCR System；核酸提取仪：德国QIAGEN 公司；电泳仪：Bio-Rad 公司；凝胶成像系统：Bio-Rad GelDoc EZ。

HiScript II U+One Step qRT-PCR Probe Kit，2×TaqMaster Mix（Dye Plus）：诺唯赞生物科技有限公司；Evo M-MLV 一步法RT-PCR 试剂盒：艾科瑞生物工程有限公司；核酸提取试剂盒：德国QIAGEN 公司；Low-Profile PCR Tubes 8-tube strip、Optically clear flat 8 Cap Strips：Bio-Rad 公司。异丙醇、无水乙醇等，均为国产分析纯试剂。

1.2 引物、探针设计及阳性质粒合成

GenBank 中下载不同国家、不同分离时间的PHEV 毒株结构蛋白（S、M、N、HE）基因序列，采用MEGA 6.0 进行序列比对，选择加拿大分离株（GenBank 登录号AF481863）N 蛋白基因为参考序列，用primer express 3.0.1 软件设计引物和探针。将该N 蛋白基因序列送至华大基因公司合成并克隆至Puc57 质粒，构建重组质粒Puc57-PHEVn。