（山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061）

奶牛乳腺炎是奶牛最常发生的疾病，给世界各国奶牛产业造成巨大损失。据报道[1]，引起奶牛乳腺炎的病原微生物有150 多种，其中以细菌为主。而细菌感染情况与地域、饲养环境及使用药物等因素有关。因此，准确掌握引发本地区奶牛乳腺炎主要致病菌的种类和耐药性，避免盲目用药，是防治该地区奶牛乳腺炎的关键。

近年来，东营市奶牛产业发展迅速，但尚未有该地区奶牛乳腺炎病原学的调查和研究报道。因此，本研究对东营市奶牛乳腺炎主要致病菌进行分离鉴定及耐药性检测，以期对该地区选择有效药物防治奶牛乳腺炎提供参考。

1 试验材料

1.1 培养基

普通营养琼脂、改良艾德华琼脂、S-S 琼脂、麦康凯琼脂等培养基和生化鉴定微量发酵管，杭州滨和微生物试剂有限公司生产。营养肉汤、绵羊血琼脂培养基，按照陈天寿[2]提供的方法自行制备。

1.2 药敏纸片

制备头孢洛宁、头孢噻呋、头孢喹肟、苄星氯唑西林、庆大霉素、利福昔明等12 种药敏纸片的原材料，参照胡桂学[3]、丁伯良等[4]提供的方法自行制备。金黄色葡萄球菌（ATCC25923）和大肠杆菌（ATCC25922），均购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.3 诊断试剂

LMT 乳腺炎诊断试剂，购自兰州畜牧与兽药研究所。

2 试验方法

2.1 奶样采集

从东营市的5 个奶牛场，参照李晓楠等[5]的方法，选取临床型乳腺炎和隐性型乳腺炎各50 例，在临床型乳腺炎乳区和隐性型乳腺炎阳性乳区，参照阮智杨等[6]的方法，无菌操作，采集奶样100 份，标记后置4 ℃冰箱冷藏保存。

2.2 病原菌分离培养

参照薛梅等[7]的方法，将处理好的奶样接种于普通营养琼脂和绵羊血琼脂平板，观察菌落形态特征，并进行革兰氏染色镜检。将符合链球菌、葡萄球菌、革兰氏阴性杆菌形态特征的菌株分别接种于改良爱德华琼脂、绵羊血琼脂、麦康凯琼脂和S-S 琼脂培养基。根据菌落形态特征、革兰氏染色特性以及镜下的细菌形态、大小和排列方式，初步判定分离细菌种类，纯化培养后保存。

2.3 细菌生化鉴定

参照薛梅等[7]、孔宪刚等[8]提供的方法，将分离纯化的细菌进行生化鉴定，确定奶样分离细菌的种类。

2.4 药敏试验

参照丁伯良等[4]提供的方法进行纸片扩散法药敏试验，并根据周婷婷等[9]提供的判定标准，判定抗菌药物敏感（S）、中介（I）和耐药（R）。

3 结果与分析

3.1 细菌分离鉴定

奶样细菌分离鉴定结果（表1）显示：100份乳腺炎奶样中，有83 份检出细菌，检出率为83.0%，其中临床型乳腺炎奶样细菌检出率为86.0%（43/50），隐性型乳腺炎奶样细菌检出率为80.0%（40/50）；单纯感染48 份、混合感染35 份；共分离到132 株细菌，其中无乳链球菌占27.27%（36/132）、金黄色葡萄球菌占26.52%（35/132）、大肠杆菌占15.15%（20/132）、停乳链球菌占12.12%（16/132），表明它们是东营市奶牛乳腺炎的主要致病菌。

3.2 药敏试验

107株主要致病菌的药敏试验结果（表2）显示：对引起东营市奶牛乳腺炎主要致病菌敏感率高的药物依次是头孢喹肟80.37%（86/107）、头孢洛宁74.77%（80/107）、头孢噻呋71.96%（77/107）和氟苯尼考67.29%（72/107），耐药率高的依次是四环素61.68%（66/107）、庆大霉素60.75%（65/107）和头孢氨苄46.73%（50/107）。

表1 100 份乳腺炎奶样的细菌分离鉴定结果

4 讨论

对东营市5 个奶牛场乳腺炎奶样进行主要致病菌分离和鉴定，发现细菌检出率较高（83.0%），说明致病菌是东营市奶牛乳腺炎的主要致病因素。本研究结果高于张青青等[10]报道的该地区乳腺炎奶样的细菌检出率，这可能与奶样采集季节、奶样采集牛场饲养管理水平不同有关。

本研究发现无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和停乳链球菌是引起东营市奶牛乳腺炎的主要致病菌（81.1%）。这与张传美等[11]、薛梅等[7]、张月[12]、李振等[13]报道的山东胶东地区、潍坊市、潍坊市临朐县、临沂市的奶牛乳腺炎主要致病菌差别不大，与阮智杨等[6]、葛影影等[14]、姚伟等[15]报道的安徽省、河南省、辽宁省奶牛乳腺炎主要致病菌差别较大，说明奶牛乳腺炎主要致病菌有地区（省）差异。

本研究未进行奶牛乳腺炎奶样中的支原体分离鉴定。但据有关报道，支原体也是引起奶牛乳腺炎的重要病原之一。张建华等[16]报道，我国大部分奶牛场存在牛支原体感染，牛支原体感染可能成为危害我国奶牛业的主要疫病。牛支原体不仅能够通过机械传播，从乳腺管侵入乳房导致乳腺炎，还可以突破血乳屏障，从呼吸道及生殖道侵入导致乳腺炎[17]。由于支原体较普通细菌难以分离鉴定，国内关于牛支原体引起奶牛乳腺炎的研究较少，本团队将加强对该病原的研究。

本研究发现，对引起东营市奶牛乳腺炎主要致病菌敏感率高的药物依次是头孢喹肟、头孢洛宁、头孢噻呋和氟苯尼考，耐药率高的依次是四环素、庆大霉素和头孢氨苄。这与张传美等[11]、张月[12]、李振等[13]报道的山东省各地区的药敏试验结果不同，与阮智杨等[6]、葛影影[14]、姚伟等[15]报道的其他省份相同致病菌的药敏试验结果也不同。抗生素是最常用于防治奶牛乳腺炎的药物，奶牛场

长期应用特别是长期滥用抗生素，会导致抗生素耐药菌株的出现[18]，造成以前常用抗生素（四环素、庆大霉素、头孢氨苄）耐药率高，而应用时间短的药物（头孢喹肟、头孢洛宁、头孢噻呋、氟苯尼考）则相对敏感。因此，在防治奶牛乳腺炎时，最好通过药敏试验选择药物。

表2 东营市奶牛乳腺炎主要致病菌药敏试验结果