韩 焘，毕一鸣，穆佳毅，彭小薇，蒋 卉，冯 宇，于广秋，郭富存，左海莉，王传彬，董 浩

（1.中国动物疫病预防控制中心，北京 100125；2.中国兽医药品监察所，北京 102618；3.建昌县畜牧兽医局，辽宁建昌 125300；4.包头市九原区动物疫病预防控制中心，内蒙古包头 014060）

布鲁氏菌病（简称布病）是一种由感染布鲁氏菌引起的危害严重的人兽共患病。布鲁氏菌主要侵害患病动物的生殖系统，以母畜流产和公畜睾丸炎为主要特征。人感染布鲁氏菌后，主要表现发热、乏力、流产、睾丸炎等，严重影响患者的生活质量，甚至丧失劳动能力和生育能力[1]。

布病在全球广泛流行，每年人间新发布病病例数超过50 万[2]。而世界卫生组织（WHO）指出，真实的人间发病率应为报告数字的10～25 倍[3-4]。目前，我国人间和畜间布病流行形势不容乐观。中国疾病预防控制中心公布的2019 年法定传染病报告显示，2019 年共新增人间布病病例44 036 例，病例数仍处于历史高位。2013—2017 年，国家动物布病参考实验室从有流产症状的布病非免疫牛场采集23 381 份血清样本进行布鲁氏菌血清抗体检测，发现平均个体阳性率高达44.2%[5]。

在布病流行率较高地区，使用疫苗免疫被证明是一种经济、有效的家畜布病控制方法。我国目前使用的布鲁氏菌疫苗主要有A19、M5（M5-90）和S2 三种。在早期研究中，辽宁省建昌县探索出一种S2 疫苗阴道喷灌的新型免疫技术。通过使用此技术，该县的羊流产率和每年新增人布病病例数大幅下降[6]。但早期研究仅对S2 疫苗阴道喷灌免疫的抗体消长规律等进行了相关研究，缺乏该免疫技术对免疫动物安全性的相关研究[7-9]。本研究使用S2 疫苗阴道喷灌方式免疫3 只母羊，免疫1 个月后测定免疫母羊的抗体滴度、体内不同脏器的含菌量，观察肝脏和脾脏的病理变化，初步评价这种免疫技术的安全性。

1 材料与方法

1.1 试验样本

临床组织样品采自辽宁省某羊场的3 只布鲁氏菌S2 疫苗株阴道免疫1 个月的山羊（阴道免疫剂量为1×1010CFU/只）和同群的3 只未免疫布鲁氏菌S2 疫苗株的山羊（阴性对照）。采集6 只山羊的血清样品，用于抗体水平测定；采集6 只山羊的心、肝、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结和颌下淋巴结样品各1 份并做好标记，由国家动物布鲁氏菌病参考实验室经组织匀浆后进行疫苗菌株的分离和核酸提取；采集6 只山羊的肝脏和脾脏样品浸于装满4%多聚甲醛的50 mL 离心管中进行固定。

1.2 主要试剂与仪器

布鲁氏菌活疫苗（S2 株），购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司；布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原、试管凝集试验抗原，购自中国兽医药品监察所国家动物布鲁氏菌病参考实验室；4%多聚甲醛固定液，购自碧云天生物技术有限公司；QIAamp DNA Mini Kit，购自Qiagen 公司；GoTaq®Probe qPCR Master Mix，购自Promega公司；荧光定量PCR 所有引物探针，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

Qiagen tissue lyser II 组织研磨仪，购自QIAGEN 公司；Gentier 96E 全自动医用PCR 分析系统，购自西安天隆科技有限公司；数显恒温水浴锅，购自苏州威尔实验用品有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 免疫抗体检测 对阴道免疫S2 疫苗株1个月的3 只山羊和同群未免疫山羊进行采血和血清分离，采用虎红平板凝集试验和试管凝集试验检测所有山羊的抗体水平。试验操作按照GB/T18646—2018 进行。

1.3.2 细菌分离 将无菌采集的6 只羊的组织脏器，剪取小块后放入2 mL 离心管中，加入1 mL 无菌的PBS 缓冲液和钢珠，使用Qiagen tissue lyser ii组织研磨仪将组织研碎；分别取200 μL 匀浆液涂布于选择培养基上，置于普通培养箱中37 ℃培养10 d。具体操作步骤和选择培养基的配置方式参照GB/T 18646—2018。所有羊组织脏器的细菌分离试验均在中国兽医药品监察所生物安全三级实验室开展。

1.3.3 组织样品核酸提取 使用QIAamp DNA Mini Kit，对200 μL 各种组织样品的匀浆液，按照试剂盒说明书提取核酸。

1.3.4 荧光定量PCR 方法 使用荧光定量PCR方法，检测提取的布鲁氏菌核酸。布鲁氏菌荧光定量PCR 方法，参考相关文献中发表的基于IS711序列的检测方法[10]。使用Gentier 96E 全自动医用PCR 分析系统进行荧光定量PCR 扩增。上游引物序列为5'-cgctcgcgcggtggat-3'，下游引物序列为5'-cttgaagcttgcggacagtcacc-3'，探针序列为5'-FAMacgaccaagctgcatgctgttgtcgatg-BHQ1-3'。荧光定量PCR 的反应体系为：GoTaq®Probe qPCR Master Mix 10 µL，10 µmol/L 的上下游引物各0.6 µL，10µmol/L 的探针0.6 µL，DNA 模板2 µL，加入无核酸酶的水补齐20 µL。扩增程序为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60℃ 1 min，40 个循环。每个循环第2 步，60 ℃ 1 min，收集荧光信号。

1.3.5 病理学分析 组织包埋切片、切片HE 染色和病理学分析，由武汉赛维尔生物科技有限公司完成。

1.3.5.1 固定组织切割 将组织从固定液中取出，在通风橱内用手术刀切割，组织厚度为3 mm 左右。将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。

1.3.5.2 组织脱水 将脱水盒放进吊篮于脱水机内依次梯度脱水：75%酒精4 h-85%酒精2 h-90%酒精2 h-95%酒精1 h-无水乙醇I 30 min-无水乙醇II 30 min-醇苯5～10 min-二甲苯I 5～10 min-二甲苯II 5～10 min-蜡I 1 h-蜡II 1 h-蜡III 1 h。若不同组织的脱水程序不同，还应详细注明。

1.3.5.3 组织石蜡包埋 将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前，将组织从脱水盒内取出放入包埋框并贴上对应的标签。包埋好的蜡块置于-20 ℃冻台上冷却；蜡凝固后，将蜡块从包埋框中取出并修整。

1.3.5.4 石蜡切片 将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚为4 μm。切片漂浮于摊片机40 ℃温水上时，将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60 ℃烘箱内烤片；待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。

1.3.5.5 石蜡切片脱蜡至水 依次将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-无水乙醇Ⅰ10 min-无水乙醇Ⅱ10 min-95% 酒精5 min-90%酒精5 min-80%酒精5 min-70%酒精5 min-蒸馏水洗。

1.3.5.6 苏木素染细胞核 切片入Harris 苏木素染3～8 min，自来水洗；1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗；0.6%氨水返蓝，流水冲洗。

1.3.5.7 伊红染细胞质 切片入伊红染液中染色1～3min。

1.3.5.8 切片脱水封片 将切片依次放入95%酒精I 5 min-95%酒精II 5 min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

1.3.5.9 染色后切片镜检 将染色封固后的切片至于正置白光显微镜下镜检染色质量，以细胞核蓝色，细胞浆红色，红色与蓝色对比清晰作为染色合格标准。

1.3.5.10 成像以及病理分析 使用正置光学显微镜或切片扫描仪数字扫描成像后观察，描述其主要病理改变，拍摄或截取对应描述中不同的典型病变部位并用不同颜色箭头标识。

2 结果

2.1 免疫抗体检测

虎红平板凝集试验结果显示，3 只免疫山羊的血清均为阳性；试管凝集试验结果显示，3 只免疫山羊的血清均在1:100 稀释时出现50%凝集。同群饲养的3 只未免疫的山羊虎红平板凝集试验和试管凝集试验均为阴性。

2.2 细菌分离

3 只免疫山羊和同群3 只未免疫山羊的心、肝、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结和颌下淋巴结样品，经37 ℃温箱培养10 d，均未分离到布鲁氏菌。

2.3 核酸检测

3 只免疫羊的各组织中，均能检测到布鲁氏菌核酸（表1），而同群饲养的3 只未免疫羊均未检测到布鲁氏菌核酸。

表1 3 只免疫羊组织中布鲁氏菌核酸的荧光定量PCR 检测结果（Ct 值）

2.4 组织病理检测

对免疫组和对照组的6 只羊进行剖检，可见免疫组3 只羊的肝脏和脾脏与对照组相比，均未发生明显肿大。进一步采集免疫组和对照组羊只的脾脏样品和肝脏样品进行组织病理检测发现：免疫组羊的脾脏组织（图1-A 和1-B）中广泛可见肝细胞轻度水肿、胞质疏松淡染（黑色箭头），局部汇管区胆管周围可见较多淋巴细胞灶性浸润（黄色箭头），局部汇管区周围可见少量结缔组织增生（红色箭头）；对照组羊的脾脏（图1-C 和1-D）红髓白髓分界清晰，脾小结形状规则，淋巴细胞数量丰富、排列紧密，红髓中可见较多中性粒细胞浸润（黑色箭头）。

肝脏的病理检测结果显示：免疫组羊的肝脏组织（图2-A 和2-B）中广泛可见肝细胞轻度水肿，胞质疏松淡染（黑色箭头），局部汇管区胆管周围可见较多淋巴细胞灶性浸润（黄色箭头），局部汇管区周围可见少量结缔组织增生（红色箭头）。对照组羊的肝脏组织（图2-C 和2-D）中广泛可见肝细胞水肿，胞质疏松淡染（黑色箭头）；局部汇管区胆管周围可见较多淋巴细胞灶性浸润（黄色箭头）；局部胆管内可见较多脱落的上皮细胞（红色箭头）。

图1 免疫组和对照组羊只的脾脏病理检测结果（20×）

图2 免疫组和对照组羊只的肝脏病理检测结果（20×）

3 讨论

S2 疫苗是我国目前应用最为广泛的家畜布鲁氏菌疫苗。该疫苗于1952 年由中国兽医药品监察所筛选自然弱毒株研制而成。20 世纪70 年代，该疫苗的广泛使用有效控制了我国家畜布病疫情的流行。该疫苗主要通过口服、皮下或肌肉注射方式接种。口服免疫虽然使用较为广泛，但抗体阳转率低；皮下或肌肉注射虽然阳转率高，但会造成怀孕动物流产。辽宁省建昌县经过多年临床实践，建立了阴道途径免疫技术。该技术既可以激发较高的抗体阳转率，又不会造成怀孕动物流产[6]。早期研究主要针对动物阴道免疫的抗体消长规律，而未知该途径免疫动物的体内细菌持续时间、主要脏器病理变化等问题。因此，本研究对上述问题进行了初步研究。

对3 只山羊经阴道免疫1 个月后进行扑杀采样检测，发现3 只羊都发生了抗体阳转，而在其所有脏器中均未分离到布鲁氏菌，说明该疫苗株毒力较弱，侵入动物机体后能很快被宿主清除。国家动物布鲁氏菌病参考实验室关于S2 疫苗株毒力评价的研究结果显示，S2 疫苗株在小鼠和豚鼠动物感染模型的平均持续时间小于4 周[11-12]，这与本研究的羊体内细菌分离结果吻合。同时，本研究的这一结果也证明了《国家布鲁氏菌病防治计划（2016—2020 年）》中“一类地区免疫牛羊，在免疫45 d后可以凭产地检疫证明在一类地区跨省流通”的移动控制要求是具有科学性的。

与细菌分离的全阴性结果相比，3 只免疫羊的大部分组织脏器中都呈现布鲁氏菌核酸阳性。这一结果一定程度上说明了荧光定量PCR 的敏感性高于细菌分离，但也暴露出分子生物学检测方法的弊端，即无法确定样品中的细菌是否存活。

免疫组3 只羊免疫后均未引起肝脏和脾脏肿大，且免疫组羊的肝脏和脾脏均未出现炎性坏死和特征性肉芽肿等布鲁氏菌病感染相关的病理变化[13]，说明该免疫技术对羊是安全的，不会对免疫羊造成明显的病理损伤。同时，在免疫过程中，通过做好生物安全防护和在免疫前后场地的充分消毒，可以极大降低疫苗株感染接种人员的风险。