李梦圆, 徐金龙, 刘 咏, 王军辉

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

花菇是一种大型真菌,素有“山珍”之称,属于担子菌纲(Basidiomycotina),伞菌目(Agaricales),白蘑科(Tricholomataceae)。黄山花菇产自安徽黄山,是黄山的一大特产,是可蔬可药的山中珍品,其营养丰富,含有多糖、氨基酸、维生素、核酸、甾醇类等多种成分。特别是花菇多糖(floral mushroom polysaccharides,FMPS)有抗瘤、抗癌、降血糖、增强免疫力等功效[1-2]。目前国内外关于FMPS的研究多集中在多糖提取方面,而对其生物活性的研究报道较少[2-4]。本课题组已经对黄山花菇多糖的理化性质、流变学性质和抗氧化活性进行了研究,得出其为三螺旋结构,主链由(1→3)-β-D-Glcp组成,在主链O-6的位置连有支链T-β-D-Glcp,溶液为假塑性流体,对于DPPH自由基和羟基自由基有很强的清除能力,具有一定的Fe2+螯合能力和ABTS自由基清除能力[5-6]。有报道证实硫酸基团的加入可以改变多糖的理化性质和链构象,而且其抗肿瘤活性有明显的增强[7]。

本实验采用氯磺酸-吡啶法对FMPS进行硫酸化修饰,通过正交试验对修饰条件进行优选,并用MTT法测定了硫酸化产物的体外抗肿瘤活性,旨在选出硫酸化修饰的最佳条件和抗肿瘤的最佳质量浓度,为黄山花菇多糖进一步研究和功能性食品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

黄山花菇干品购自安徽省黄山市,经高速药物粉碎机粉碎后备用;肝癌细胞株(HepG2),购自Hyclone公司;DMEM/High-Glucose培养基,购自Thermo公司;丙酮、石油醚、乙醇、氯仿、正丁醇、硼氢化钠、氢氧化钠、氯磺酸、二甲基甲酰胺、吡啶、明胶、氯化钡、三氯乙酸和无水硫酸钠等均为分析纯(AR),购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

ST-16R 高速冷冻离心机(Thermo Fisher Scientific公司);W201B 旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司);FD-1A-50 冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);Nicolet 67 红外光谱仪(Thermo公司);SW-CJ-1F超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);MCO-17AIC CO2培养箱(日本三洋电机株式会社);XD-202 倒置显微镜(南京江南永新光学有限公司);Multiskan Go 1510 酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 黄山花菇多糖的提取

称取150 g花菇粉末,用5 L 0.05% NaBH4/5% NaOH溶液在室温下提取2 h,2次提取后,合并滤液,用乙酸中和,旋转蒸发仪减压浓缩至溶液体积为300 mL,加入4倍体积的95%乙醇醇沉24 h,抽滤得沉淀,将沉淀复溶于蒸馏水,用Seveg试剂(三氯甲烷与正丁醇体积比为5∶1)脱蛋白,Seveg试剂与糖液体积比为1∶5～1∶4,重复操作几次,直至无明显蛋白质析出。用分液漏斗除去蛋白质,糖液减压蒸馏浓缩,去除三氯甲烷。加H2O2脱色3～4 h,透析,冷冻干燥,得黄山花菇多糖FMPS,提取率为4.7%。

1.4 氯磺酸吡啶法进行多糖硫酸化

精确称取100 mg FMPS,室温下磁力搅拌溶于10 mL二甲基甲酰胺(DMF)中。在三口瓶中放入25 mL吡啶,加入一定体积的氯磺酸,反应置于冰盐浴中并不断搅拌。充分混合后,将溶解于DMF中的多糖加入三口瓶中并移至150 ℃油浴中反应。然后冷却至室温,倒入100 mL冰水中,用2.5 mol/L NaOH中和,加入95%乙醇沉淀。离心,取沉淀复溶于水中,用自来水透析2 d,再用去离子水透析1 d,冷冻干燥得黄山花菇硫酸酯化多糖(FMPS-S)[8]。

1.5 正交实验的因素和水平

据文献报道,反应温度、试剂的配比和反应时间对硫酸化修饰的影响较大[9]。因此选用反应温度(A)、氯磺酸与吡啶的体积比(B)和反应时间(C)作为因素,每个因素取3个水平,以硫酸基的取代度为指标,选用正交表L9(34)进行正交试验,见表1所列。

表1 因素水平

1.6 红外光谱测定

采用溴化钾压片法[10],称取1～2 mg硫酸化前和硫酸化后的多糖样品,与溴化钾一起研磨,混合均匀后压片,在傅里叶红外光谱仪上测定,扫描范围为4 000～500 cm-1。

1.7 硫酸酯化多糖硫酸基质量分数测定

1.7.1 硫酸基标准曲线绘制

精确吸取0.6 mg/mL标准Na2SO4溶液0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mL,以1 mol/L HCl溶液补至0.2 mL。以0.2 mL 1 mol/L的HCl溶液为空白,加入3.8 mL 3%的三氯乙酸和1 mL 5 mg/mL的氯化钡溶液。摇匀,室温静置15 min后于360 nm测吸光度A1;以1 mL 5 mg/mL的明胶溶液代替5 mg/mL BaCl2溶液测吸光度A2。以硫酸基毫克数为横坐标,吸光度(A1-A2)为纵坐标,平行做3次,取平均值制作硫酸基质量分数标准曲线[11-12],得回归方程为:

y=0.334x-0.023 5,R2=0.998 4。

1.7.2 硫酸基质量分数测定

分别称取硫酸化前和硫酸化后样品30 mg放入50 mL容量瓶,加入10 mL 的1 mol/L HCl溶液中,100 ℃水解3 h,冷却后加1 mol/L HCl溶液定容至50 mL,过滤除去不溶物。取样液0.2 mL按照标准曲线制备方法测得吸光度A1、A2。根据A1-A2的数值在硫酸基标准曲线中得出样品硫酸基毫克量并计算硫酸根取代度(DS)：

DS=(1.62wS)/(32-1.02wS)，

其中,wS为多糖中硫元素质量分数。

1.8 体外抗肿瘤实验

取90 μL细胞液于96孔板中,细胞密度约为1×105个/mL,置于37 ℃、5% CO2培养箱培养4 h后,加入10 μL不同质量浓度(20、50、100、200、500 μg/mL)的黄山花菇多糖FMPS及硫酸化后的多糖,继续培养24 h,加入20 μL 5 mg/mL的MTT试剂培养4 h,移去上清液,加入200 μL DMSO,振荡10 min后用酶标仪在570 nm下测定吸光度值。多糖对肝癌细胞的抑制率的计算公式为:

抑制率=[(Abs0-Abs1)/Abs0]×100%,

其中,Abs1、Abs0分别为样品组和对照组的吸光度值。

1.9 数据处理

采用Orign 8.0软件绘制图表,利用SPSS 22.0软件进行数据统计处理,*p<0.05表示差异显著,**p<0.01表示差异极显著。

2 结果分析

2.1 正交试验结果

正交试验结果见表2所列,FMPS-S2和FMPS-S5比较得出,当试剂比例和时间一定时,温度上升时硫酸基取代度增加;从FMPS-S5和FMPS-S6得出,温度和时间不变,吡啶量减少取代度增加;比较FMPS-S6和FMPS-S7,时间不变吡啶的量上升后取代度应该下降,然而试验结果表明取代度上升,证明温度上升时取代度上升,且温度比试剂比例对取代度的影响更大;比较FMPS-S6和FMPS-S9,试剂比例不变,温度上升取代度应该上升,然而试验结果是取代度下降,表明时间变短取代度降低,且比温度对取代度的影响更大。由极差R也可以得出,影响多糖FMPS硫酸酯化取代度DS的因素主次顺序为C>A>B,这和推论出的结果一致,但与文献[13]得出的结论(A>C>B)有差异,这可能由于在高温下进行多糖硫酸化破坏了多糖的结构,使其降解,而随着反应时间的增加,反应物充分接触,反应得以完全发生,导致硫酸化取代度DS随之升高,因此高温下反应时间开始占主导地位。根据取代度DS的数值可以得出FMPS硫酸酯化最佳条件为A3B2C3,即反应温度100 ℃,氯磺酸与吡啶的比例1∶4,反应时间4 h,在此条件下多糖FMPS的硫酸基取代度可达到2.08。

表2 多糖FMPS硫酸酯化的正交试验结果

2.2 红外光谱分析结果

选取黄山花菇原糖和3种不同取代度的硫酸酯化多糖进行红外光谱测定,结果如图1所示。FMPS的紫外图谱在文献[5]中已被分析,表明其具有多糖特征峰、无硫酸基团。与未被硫酸化修饰的FMPS相比,3种硫酸化的多糖在3 600～3 200 cm-1、3 000～2 800 cm-1、1 400～1 000 cm-1处也出现了多糖的特征峰[14],并且出现了2个新的吸收峰。位于1 248 cm-1处的吸收峰归因于非对称的S=O伸缩振动;位于810 cm-1处的吸收峰是C—O—S的对称振动峰[15-16]。红外光谱图表明FMPS的硫酸化修饰成功,进一步证实了—OSO3-1基团的加入。

图1 不同硫酸基黄山花姑多糖的红外光谱图

2.3 抗肿瘤活性结果

抗肿瘤活性结果如图2所示,从图2可以看出，所有黄山花菇多糖对肝癌细胞HepG2都有一定的抑制作用,在相同质量浓度下硫酸酯化黄山花菇多糖FMPS-S对肝癌细胞的抑制活性明显高于黄山花菇多糖FMPS。不同的硫酸化修饰黄山花菇多糖的抑制活性与质量浓度表现出不同的相互关系,FMPS-S2、FMPS-S3、FMPS-S4、FMPS-S5和FMPS-S8对HepG2的抑制活性随着多糖质量浓度的增加而增强,在质量浓度为500 μg/mL时达到最大,抑制率分别为42.30%、9.95%、17.27%、16.25%、33.81%。FMPS-S1和FMPS-S9对HepG2的抑制活性随着质量浓度的增加先增强后减弱,在质量浓度为100 μg/mL时具有最大活性,抑制率为8.25%和25.30%。FMPS-S6和FMPS-S7对HepG2的抑制活性随着质量浓度的增加先增强后减弱,在质量浓度为200 μg/mL时具有最大活性,抑制率达到19.82%和16.44%。从图2还可以看出,FMPS-S2在各个质量浓度下均有最好的肿瘤抑制活性,其硫酸基取代度为1.90,并不是所有硫酸化多糖中最高的,表明FMPS-S2有一个最佳的取代度以使其具有最好的肿瘤抑制活性。综上所述,硫酸基取代度有一个最佳值，而不是越高越好,不同硫酸化条件得到的硫酸化黄山花菇多糖表现出最高抗肿瘤活性的最适质量浓度不同。

图2 FMPS和FMPS-S对肝癌细胞HepG2的体外抑制作用

3 结 论

从正交试验结果可以得出硫酸化修饰的最佳反应条件如下:反应温度为100 ℃,氯磺酸与吡啶的比例为1∶4,反应时间为4 h,在该条件下黄山花菇多糖FMPS的硫酸基取代度可以达到最大值。体外抗肿瘤活性实验结果表明,FMPS具有一定的抗肿瘤活性,硫酸化修饰使FMPS的抗肿瘤活性进一步提高,并且不同硫酸基取代度黄山花菇多糖的抗肿瘤活性表现出不同的质量浓度依赖性。