王春霞 岳师师 毛炎佳

[摘要] 目的 探討补肾助孕汤对体外培养大鼠卵巢颗粒细胞生长中Smad3、Smad4的表达作用，为中药复方的研究提供实验数据支撑。 方法 用生长良好的大鼠颗粒细胞，调整细胞为1×104 cells/1 mL，用24孔细胞培养板，每孔滴入少许培养基，然后放入直径24 mm的盖玻片，让培养液与玻片粘合在一起，每孔再加入细胞悬液37℃ 5%CO2进行培养，在6 h、12 h、24 h进行观察培养细胞的贴片情况，用免疫组化SP法染色镜检。 结果 补肾助孕汤各剂量组用药后Smad3、Smad4的阳性率均高于对照组，Smad3：高剂量组用药6 h、12 h、24 h分别与对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05），中剂量组用药6 h、12 h、24 h分别与对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05），低剂量组用药12 h高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），各剂量组用药12 h最高，其高于用药6 h、24 h，差异有统计学意义（P<0.05）;Smad4：高剂量组和中剂量组用药6 h、12 h、24 h与对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05），低剂量组用药12 h高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 补肾助孕汤能够促进体外培养的卵巢颗粒细胞的增殖分化，通过促进TGF-β1的含量上调Smad3、Smad4的表达，从而促进卵泡生长发育。

[关键词] 补肾助孕汤;卵巢颗粒细胞;Smad3;Smad4;信号通路

[中图分类号] R329          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）15-0040-04

Study of the effect of kidney tonifying and gestation promoting decoction on rat ovarian granulosa cells Smad3 and Smad4

WANG Chunxia1   YUE Shishi2   MAO Yanjia2   JIANG Yaru2   LIU Yuchun1   YAN Sha1   LI Yongwei1

1.He'nan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine， Zhengzhou  450002， China; 2.He'nan University of Chinese Medicine， Zhengzhou   450046， China

[Abstract] Objective To explore the effect of kidney tonifying and gestation promoting decoction on the expression of Smad3 and Smad4 in the growth of rat ovarian granulosa cells through in vitro culture， so as to provide experimental data support for the research of traditional Chinese medicine compound prescription. Methods Rat granulosa cells with good growth were chosen and adjusted to 1×104 cells/1 mL. A little culture medium was dropped into each well of 24-well cell culture plates， and then a cover glass with a diameter of 24 mm was put in to be bonded to the culture solution. Cell suspension 37°C 5% CO2 was added to each well for culture. The patch of cultured cells was observed at 6 h， 12 h， 24 h， and was given immunohistochemical SP staining and microscopic examination. Results The positive rates of Smad3 and Smad4 in each dose group of kidney tonifying and gestation promoting decoction were higher than those in the control group. Smad 3： High-dose group and the control group were compared at 6 h， 12 h， and 24 h of administration， with statistically significant difference（P<0.05）. Medium-dose group and the control group were compared at 6 h， 12 h， and 24 h of administration， with statistically significant difference（P<0.05）. The positive rate in low-dose group at 12 h of administration was higher than that in the control group， with statistically significant difference（P<0.05）. In all dose groups， the positive rate at 12 h of administration was higher than that at 6 h and 24 h， with statistically significant difference（P<0.05）. Smad4： High-dose group and medium-dose group at 6 h， 12 h， and 24 h of administration， were compared with the control group， with statistically significant difference（P<0.05）. The positive rate of low-dose group at 12 h of administration was higher than that of the control group， with statistically significant difference（P<0.05）. Conclusion Kidney tonifying and gestation promoting decoction can promote the proliferation and differentiation of ovarian granulosa cells in vitro， and regulate the expression of Smad3 and Smad4 up by increasing the content of TGF-β1， so as to accelerate the growth and development of follicles.

[Key words] Kidney tonifying and gestation promoting decoction; Rat ovarian granulosa cell; Smad3; Smad4; Signal pathway

卵巢颗粒细胞是卵泡的功能单位，其增殖、分化与卵泡的生长发育密切相关[1]。而颗粒细胞主要通过本身的分化、信号通路的转导以及分泌的细胞因子发挥作用。Smads蛋白是TGF-β信号通路唯一的底物蛋白[2]。补肾助孕汤是王春霞教授在长期临床实践中的经验方，通过多年临床观察对于恢复月经周期、促进排卵具有良好的临床效果，且临床观察中未发现并发症及副作用[3]。为了解其对卵泡生长发育的作用，本文用大鼠卵巢颗粒细胞进行实验研究，观察其对Smads蛋白的变化影响并分析作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验细胞

大鼠卵巢颗粒细胞购于武汉原生原代生物医药科技有限公司，产品编号：RAT-CELL-0077，规格：5×105 cells/1 mL。

1.2 实验用药与耗材

补肾助孕汤（菟丝子，规格：10 g/袋，批号：1905006C、当归，规格：10 g/袋，批号：1906013C、枸杞子，规格：5 g/袋，批号：1906001C、熟地，规格：10 g/袋，批号：1905004W、制何首乌，规格：10 g/袋，批号：1812003C、白芍，规格：10 g/袋，批号：1906001W、川芎，规格：6 g/袋，批号：1906003C、黄芪，规格：10 g/袋，批号：1907001W、炙淫羊藿，规格：10 g/袋，批号：1901002C、山药，规格：10 g/袋，批号：1904006W、牛膝，规格：5 g/袋，批号：1906001C;三九制药）。注射用尿促性素针（HMG），丽珠集团丽珠制药厂，规格：75 U，批号：180504;细胞培养基：批号：0012519，BI生物公司;牛血清：批号：1924622，BI生物公司;大鼠单抗Smad3/Smad4免疫组化试剂，批号：bs-4539R，武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 实验分组及检测

选择生长良好的大鼠颗粒细胞，用细胞计数板进行计数，调整细胞为1×104 cells/mL，用24孔细胞培养板，每孔滴入少许培养基，然后放入直径24 mm的盖玻片，让培养液与玻片粘合在一起，每孔再加入细胞悬液进行培养分为对照组（空白）、高剂量组（含生药3.24 g/mL）、中剂量组（含生药1.62 g/mL）、低剂量组（含生药0.81 g/mL）、HMG组（阳性对照组），每组6孔37℃ 5%CO2进行培养，进行细胞爬片，在6 h、12 h、24 h进行观察，用免疫组化SP法染色镜检，细胞核被染成紫蓝色阳性，观察阳性细胞百分比进行分析。

1.4 统计学方法

采用R3.5.3进行统计描述与推断。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用重复测量资料方差分析进行统计推断，分析变量间的交互效应、主效应、单独效应及多重比较，α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同含量补肾助孕颗粒对大鼠卵巢颗粒细胞Smad3、Smad4的核阳性率比较

补肾助孕汤各剂量组用药后Smad3、Smad4的阳性率均高于对照组，Smad3：高剂量组用药6 h、12 h、24 h分别与对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05），中剂量组用药6 h、12 h、24 h分别与对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05），低剂量组用药12 h高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），各剂量组用药12 h最高，其高于用药6 h、24 h，具有统计学意义（P<0.05）;Smad4：高剂量组和中剂量组用药6 h、12 h、24 h与对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05），低剂量组用药12 h高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 时间因素、分组因素主效应及其交互效应统计推断结果

对于Smad3、Smad4阳性率，时间因素与不同剂量药物分组因素间存在交互效应，统计推断结果具有统计学意义;时间因素主效应与分组因素主效应同样具有统计学意义。见表2。

2.3 补肾助孕汤剂量分组因素与时间因素的单独作用及多重比较

2.3.1 分组因素  剂量分组因素的单独效应分析结果见表1，各时间点固定时各组间差异具有统计学意义;多重比较结果见图1，95%置信区间不包含0.00点时，差异具有统计学意义。

2.3.2 时间因素  时间因素的单独效应分析结果见表1，各组固定时各时间点Smad3、Smad4阳性率差异具有统计学意义（对照组除外）;多重比较结果见图2，95%置信区间不包含0.00点时，差异具有统计学意义。

3 讨论

《内径》肾藏精，主生殖，是对人体生殖功能的高度概括，肾中之精又有先天之精和后天之精之分，先天之精得到后天之精的濡养得以升华，为肾主生殖的根本[4]。《灵枢·经脉篇》曰“人始生，先成精”。肾中精气是孕育的物质基础，精气的充盈与女性卵泡的生成、发育、成熟密切相关[5]。随着高科技的发展，人们生活节奏的加快，女性承擔的压力增大，直接影响女性生殖及内分泌功能[6]，出现卵巢早衰、多囊卵巢综合征、闭经、异常子宫出血等疾病的增多，从而影响女性卵泡的发育、成熟及排出的障碍，造成女性不孕症的增多[7]。现代研究发现补肾药物具有类激素样的作用，起到改善女性内分泌的功能，促进卵泡的发育与排出[8]。

补肾助孕汤多年临床观察总结出来的对排卵障碍性不孕症治疗的有效方剂，具有补肾填精调经助孕之功[9，10]。补肾助孕汤中熟地、菟丝子能够补肾填精;制何首乌、枸杞子和当归能够滋阴补血;白芍能够养血调经;山药、黄芪能够益气补血;川芎能够行气活血;牛膝能够引血下行;配以炙淫羊藿起到阳中求阴。方中活血化瘀药能改善卵巢微循环，起到促进卵泡发育及排卵的作用。方中的补肾药能够增强卵巢和垂体的功能，起到调节内分泌的作用。

颗粒细胞参与了原始卵泡生长发育的过程，其发挥作用的主要机制是自身分化、信号通路的转导及分泌因子达到增殖的目的。卵泡在促卵泡生长激素的作用下使颗粒细胞数增多，卵泡液增加，促进卵泡生长。促卵泡激素能够促进雌二醇的合成，而雌二醇也可反馈抑制合成促卵泡生长激素。在哺乳动物的研究中证实，在卵巢的卵母细胞到成熟卵细胞的生长过程中，TGF-β超家族成员在多个环节中起着调控作用[11]，而TGF-β1是TGF-β家族中的一个亚型，在哺乳动物卵巢中主要表达与卵母细胞相关，可促进卵泡的生长发育和卵子的成熟[12]。在前期试验中也证实了补肾助孕汤可引起TGF-β1及其受体在卵泡发育的不同阶段表达升高。在TGF-β/Smads信号传导通路中，Smad3属于Smads属下游信号传导分子，发挥核转录调控因子的作用。Smad4在TGF-β/Smads通路中起到中枢作用，能够活化Smad形成的复合物，协同调节TGF-β的基因转录，从卵泡的发育开始直至成熟及排卵后，Smad4均可持续表达[13，14]。

实验证明，卵母细胞、颗粒细胞体外培养能够促进卵细胞的发育成熟[15]。Gilchrist RB等[16]研究也发现，Ⅰ型及Ⅱ型受体结合后能够激活Smad2和Smad3，能促进颗粒细胞增殖。本研究采用空白对照和激素HMG组作为对照进行研究，实验结果表明补肾助孕汤各剂量组用药后Smad3、Smad4的阳性率均高于对照组，与阳性对照组无统计学差异。Smad3：高剂量组和中剂量组用药6 h、12 h、24 h与空白对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05），低剂量组用药12 h高于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05），各剂量组用药12 h最高，明显高于用药6 h、24 h，差异有统计学意义（P<0.05）;Smad4：高剂量组和中剂量组用药6 h、12 h、24 h与空白对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05），低剂量组用药12 h高于空白对照组，具有统计学意义（P<0.05），各剂量组用药12 h最高，其高于用药6 h、24 h，差异有统计学意义（P<0.05）。所以，补肾助孕汤在卵泡生长发育过程中能够通过TGF-β/Smads信号通路起到促进卵泡生长发育的作用。

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（收稿日期：2020-03-18）