黄朋伟，庞天宝，陈嘉捷，刘萍萍，崔新征，张清勇

1)郑州大学第二附属医院胸外科 郑州 450014 2)郑州大学医学科学院 郑州 450052 3)郑州大学基础医学院免疫学系 郑州 450001 4)郑州大学人民医院重症肌无力综合诊疗中心 郑州 450003

重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是一种乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor, AChR)抗体介导、T细胞依赖的自身免疫性疾病[1]。目前治疗方法主要包括药物治疗及胸腺切除，但其发病机制尚未明确。非神经元型胆碱能系统(non-neuronal cholinergic system,NNCS)是一种存在于上皮细胞、淋巴细胞、内皮细胞等细胞中完整的、独立的胆碱能系统，包括毒蕈碱型受体(mAChR, M1～M5)，烟碱型受体(nAChR, α1～α10、β1～β4、γ)，合成乙酰胆碱的胆碱乙酰转移酶以及分解乙酰胆碱的乙酰胆碱酯酶等[2]。Kawashima等[3]已证实该系统在免疫细胞上表达且通过自分泌/旁分泌调节免疫功能。研究[4-5]发现激活α7 nAChR可增强T细胞的免疫抑制功能，抑制免疫细胞炎性因子的释放。本研究主要检测了MG患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中α7 nAChR的表达，并在T细胞活化的基础上，进行α7 nAChR拮抗/激活干预，观察α7 nAChR对T细胞增殖及相关细胞因子表达的影响，为后续研究其作用机制奠定基础。

1 对象与方法

1.1研究对象选取2018年9月至2019年3月郑州大学第二附属医院收治的MG患者共20例，年龄9～63(31.2±7.9)岁，男女各10例。患者均根据临床症状、新斯的明试验、乙酰胆碱受体抗体、重频刺激试验、肌电图和胸部CT确诊为MG，排除其他自身免疫性疾病、严重感染、严重器官不全等的患者，排除服用溴吡斯的明片，服用激素或其他免疫抑制剂者。选取郑州大学第二附属医院体检人员(无自身免疫性疾病、严重感染，未服用激素或免疫抑制剂等)20例为健康对照，年龄14～55(30.4±6.8)岁，男女各10例。该研究得到郑州大学第二附属医院伦理委员会的批准，患者及体检人员均签署知情同意书。

1.2主要仪器和试剂流式细胞仪(BD公司，型号：Accuri C6)、RT-2100C酶联免疫检测仪(Rayto公司)、实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司)。抗人CD3单抗、抗人CD28单抗、抗CD8-APC抗体、抗CD4-PE抗体(Invitrogen公司)，抗人α7 nAChR抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(Biolengd公司)，IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12 ELISA检测试剂盒(Invitrogen公司)，反转录试剂盒(TaKaRa公司)，人外周血淋巴细胞分离液(北京索莱宝科技有限公司)，荧光染料CFSE、Trizol(Invitrogen公司)，α7 nAChR激动剂、α7 nAChR拮抗剂(APExBIO公司)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成。

1.3样本采集、PBMC及血清的分离抽取MG患者组和健康对照组肘正中静脉血共8 mL(6 mL置于肝素抗凝管)，抗凝试管血与PBS 1∶1混匀，加入等体积细胞分离液，1 500 r/min离心20 min，PBS洗涤2次后得PBMC；取未抗凝血样，离心收集血清，-80 ℃保存，用于细胞因子的检测。

1.4PBMC中α7nAChR mRNA的检测用Trizol提取PBMC总RNA，反转录为cDNA，进行α7 nAChR荧光定量PCR，内参选管家基因GAPDH，引物序列见表1。PCR反应体系：模板cDNA 1 μL，0.3 μmol/L上下游引物各0.5 μL，Taq-Mix 5 μL，H2O 3 μL。按2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

表1 引物序列

1.5PBMC中α7nAChR蛋白的检测从分离的PBMC中提取蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转移到PVDF膜上。室温下BSA封闭2 h，加入α7 nAChR抗体(按1∶500稀释)，4 ℃孵育过夜，TBST漂洗后，室温下加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG孵育1 h。ECL法显色。用Image-Pro Plus 6.0分析条带灰度值，以目的蛋白条带和内参条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.6外周血细胞因子水平的检测采用ELISA检测MG患者组和健康对照组血清IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12水平，具体操作按说明书进行。

1.7PBMC的标记、T细胞的活化及处理取MG患者PBMC，用PBS调整细胞密度为1×107个/mL，加入终浓度为2.5 μmol/L的CFSE进行染色，用RPMI 1640重悬细胞。在CFSE标记的MG患者的PBMC中，加入抗人CD3单抗(终质量浓度1 mg/L)和抗人CD28单抗(终质量浓度0.5 mg/L)活化T细胞，接种于24孔板，调整细胞密度为3×105个/孔，分别加入PBS(空白对照组)、α7 nAChR拮抗剂(拮抗剂组，终浓度10 μmol/L)、α7 nAChR激动剂(激动剂组，终浓度10 μmol/L)，用含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/L链霉素的RPMI 1640，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养72 h。

1.8T细胞培养液上清细胞因子水平及增殖活性的检测①收集3组细胞，4 000 r/min离心3 min，吸取培养液上清，采用ELISA检测IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12水平，具体操作按说明书步骤进行。②用PBS洗涤细胞，加50 μL 缓冲液重悬细胞，分别加入抗CD4-PE抗体和抗CD8-APC抗体，4 ℃孵育30 min，4 000 r/min离心3 min，弃上清，加入200 μL缓冲液重悬，上流式细胞仪检测。未刺激的细胞具有较强CFSE的染色荧光(单峰)；抗CD3/CD28诱导活化后，增殖的淋巴细胞出现逐渐递减的CFSE染色荧光(多峰)，圈门并统计各组增殖情况。

1.9统计学处理采用SPSS 21.0处理数据。应用两独立样本t检验比较健康对照组和MG患者组α7 nAChR表达及血清相关细胞因子水平的差异，应用单因素方差分析及LSD-t检验比较3组T细胞亚群增殖及细胞因子水平的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1MG患者组与健康对照组PBMC中α7nAChR表达水平的比较与健康对照组相比，MG患者组PBMC中α7 nAChR mRNA及蛋白的表达水平均降低(P<0.001)(图1、表2)。

表2 2组PBMC中α7 nAChR mRNA及蛋白表达水平的比较

2.2MG患者组与健康对照组血清细胞因子水平的比较与健康对照组相比，MG患者组血清IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-12水平升高(P<0.001)，而IL-4、IL-10水平2组间相比，差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

表3 2组血清IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12水平的比较 ng/L

2.3α7nAChR对MG患者T细胞分泌IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12水平的影响与空白对照组相比，α7 nAChR拮抗剂组培养液上清IFN-γ、TNF-α、IL-6水平升高，α7 nAChR激动剂组IFN-γ、TNF-α、IL-6水平则降低(P<0.05)；IL-4、IL-10、IL-12在3组中的水平差异均无统计学意义(P>0.05)(表4)。

表4 3组培养液上清IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12水平的比较 ng/L

2.4α7nAChR对MG患者T细胞亚群增殖的影响与空白对照组相比，α7 nAChR拮抗剂组T细胞亚群增殖增强，而α7 nAChR激动剂组T细胞亚群增殖减弱(P<0.05)(表5)。

1：健康对照组；2：MG患者组

表5 3组T细胞亚群增殖率的比较 %

3 讨论

MG是发生在神经肌肉接头处、AChR抗体介导的、补体参与的自身免疫性疾病[6]。通常采用药物治疗效果不佳时，胸腺切除术亦为一种有效的治疗手段。MG新的治疗方法也在不断探索中。随着对NNCS的深入研究，越来越多的证据证明α7 nAChR在抗炎和免疫调节中发挥重要作用。Schubert等[7]发现α7 nAChR在关节炎发病过程中起免疫调节作用，与此同时，Skok等[8]发现激活α7 nAChR可增强骨髓中B细胞的存活，表明α7 nAChR在调节抗体的产生及自身免疫性疾病中发挥重要作用。王金荣等[9]发现在关节炎大鼠PBMC中α7 nAChR表达水平显著降低，且与病情程度呈正相关。本研究结果显示MG患者PBMC中α7 nAChR mRNA及蛋白的表达水平均低于正常个体，由此猜测α7 nAChR与MG的发病有关。

研究[10-11]表明CD4+T细胞参与MG的发病，特别是Th1细胞和Th2细胞，如Th1细胞能诱导B细胞产生与补体结合的抗体。另外查阅文献[12]发现，在实验性自身免疫性MG(EAMG)小鼠中注射重组IFN-γ，结果症状更重，AChR抗体滴度更高。管宇宙等[13]发现MG患者治疗后，血清TNF-α下降，原因可能是TNF-α通过巨噬细胞及其他神经肌肉接头浸润细胞参与疾病的发生和发展。Eilertsen等[14]发现IL-6在B细胞增殖和分化过程中具有调节作用，可诱导B细胞分泌多克隆IgG。且以往研究[15]发现MG患者血清中IL-12水平升高，激素阶段性治疗后，IL-12水平下降，这些结果表明可能是AChR自身抗原刺激免疫系统，使Th1/Th2平衡失调，引起细胞因子分泌异常，参与MG的发病。本研究发现MG患者α7 nAChR表达水平降低，同时血清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-12水平升高。为进一步证实两者之间的关系，体外活化MG患者外周T细胞，并对α7 nAChR进行拮抗或激活处理，发现加入α7 nAChR拮抗剂后，上清液中IFN-γ、TNF-α、IL-6水平升高，相反，加入α7 nAChR激动剂后，IFN-γ、TNF-α、IL-6水平降低；且加入α7 nAChR拮抗后，T细胞增殖增强，反之，T细胞增殖受抑，表明α7 nAChR可能参与调控T细胞增殖。以上数据表明，α7 nAChR可能通过激活某个信号通路参与调控MG的发病。

总之，MG患者中α7 nAChR的表达异常可能影响T细胞的增殖及细胞因子的水平，从而参与MG的发病；该研究为后续深入研究α7 nAChR在MG发病机制中的作用提供了新的视角，同时可能为MG的诊断及治疗提供新的靶点。