张成，何明亮，汪威，徐芳森

（华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉 430070）

0 引言

【研究意义】通过基因编辑手段获得基因敲除材料，对于研究基因在植物中的生物学功能具有重要的意义。而获得高编辑效率的CRISPR-Cas9系统能加速获得基因敲除材料的进程。【前人研究进展】在植物基因功能研究中，靶向基因编辑技术有着十分重要的作用，特别是在目标基因与其同源基因同源性较高的情况下很难通过其他途径获得想要的突变体。近些年，基于细菌免疫系统中CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）-Cas（CRISPR associated）的靶向基因编辑技术席卷了整个生物基因组研究领域[1-2]。常用的CRISPR-Cas9系统由两部分组成：带有核定位信号的Cas9和由21 bp靶序列（tracrRNA）的CRISPR（crRNA）构成的sgRNA（synthetic guide RNA）。其中，由sgRNA转录而成的非编码RNA与带有核定位信号的Cas9蛋白结合形成复合体，在PAM（protospacer-adjacent motif，Cas9系统中为NGG）位点上游3 bp位置切割DNA产生DNA双链切割（double-stranded breaks，DSBs），继而发生同源重组修复（homology-directed repair，HDR）或非同源重组修复（nonhomologous end joining，NHEJ），而容易出错的NHRJ修复方式导致在切割位点附近发生核苷酸的随机缺失，插入或者替换[1,3]。目前，CRISPR-Cas9系统已经成功在多种植物中得以应用，包括拟南芥、水稻、玉米、番茄、小麦、油菜和烟草等[4-11]。目前，在拟南芥中主要是利用农杆菌蘸花的方法，通过T-DNA插入到拟南芥卵细胞或者胚胎干细胞中的基因组获得拟南芥转基因植株。在之前的拟南芥CRISPR-Cas9研究中，主要是利用花椰菜花叶病毒（cauliflower mosaic virus，CaMV）35s启动子启动Cas9的表达，但发现拟南芥中的编辑效率较水稻下降很多，且发生基因编辑的T1代大部分为嵌合体。这主要由于35s启动子在植物的胚胎形成过程中表达量不高，而是在营养器官中高表达量的原因[8,11]。……