刘 莹,贾敬亮,刘 涛,袁广富,陈少杰,王 晶,范京惠,左玉柱

(1.河北农业大学动物医学院,河北保定071001 ； 2.衡水市畜牧技术推广站,河北衡水053000 ； 3.石家庄市动物卫生监督所,河北石家庄050000)

猪Delta冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪流行性腹泻病毒(Porcire epidemic diarrhea virus, PEDV)均是引起仔猪腹泻病的重要病原，二者临床症状极为相似，且常常混合感染，仅根据临床上的方法较难进行鉴别与诊断，传统检测方法最大的缺点就是检测周期长，工作繁琐并配备专业人员进行检测，特异性与灵敏度也较差，因此，建立一种同时检测PDCoV和PEDV的快速检测方法具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 病毒来源 猪流行性腹泻病毒、猪Delta冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪博卡病毒(PBoV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性病料，均由河北农业大学动物医学院预防兽医实验室鉴定、保存。

1.2 仪器与试剂 DL-2 000 DNA Marker(MD114)、RT-PCR反转录试剂盒，均为宝日医生物技术(北京)有限公司产品；DNA提取试剂盒为北京全式金生物技术有限公司产品；2×TaqPCR Mix为中科瑞泰生物科技有限公司产品；Protein simple凝胶成像系统为普诺森生物科技(上海)有限公司产品。

1.3 引物设计与合成 利用 Primer 5.0 引物设计的软件，根据GenBank中收录的PEDVM基因和PDCoVM基因中获得的保守区域分别设计2对引物，预计扩增PEDV的M基因部分片段520 bp，扩增PDCoV的M基因部分片段340 bp，引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成(见表1)。

表1 PEDV与PDCoV引物信息Table 1 Primer used for amplification and sequencing of PEDV and PDCoV

1.4 病毒核酸的提取及cDNA的获取 由河北农业大学动物医学院预防兽医实验室鉴定保存的病毒阳性病料，参照RNA提取试剂盒说明书进行病毒核酸的提取，并使用RT-PCR反转录试剂盒获得cDNA。……