张婉琪,王哲红,张莹钰,王青青,崔 鑫,朱广艺,胡建军

(1.塔里木大学生命科学学院,新疆阿拉尔843300 ； 2.哈密市动物疾病预防与控制中心 ，新疆哈密839000 ； 3.塔里木大学动物科学学院,新疆阿拉尔843300 ； 4.哈密市信访局 ，新疆哈密839000)

仅对牛乳头瘤病毒部分基因序列进行分析，难以掌握病毒的遗传特性。因此，本研究从分子水平上对新疆南疆牛乳头瘤病毒1型SY-12株进行全基因组序列测定和基因组结构特征分析，为进一步开展新疆南疆乳头状瘤基因功能研究和疾病疫源追溯提供科学依据。

图4 SY-12基因组结构图
Fig.4 Structure of complete genomic sequence of the SY-12 strain
A：SY-12株基因组结构示意图；序列代表上游调控区的各结构，红色加粗代表E1结合位点(AACAAT)EIBS；绿色加粗下划线代表TATA框(TATAAAA/T)；黄色背景代表回文结构(TCGGTGCACCGA)；蓝色加粗下划线代表核因子结合位点NF-1(TTGGCA)；方框内代表多腺苷酸化信号PolyA(AATAAA)；加粗下划线代表E2结合位点(E2BS)的共有序列(ACC-N6-GGT)；双下划线代表6T串联区(TTTTTT)；灰色背景波浪线代表6A串联区(AAAAAA)
A: Genomic structure of SY-12. The sequences represent the structures of the upstream regulatory region. Bold and red texts denote the E1 binding site (AACAAT). Bold and green texts denote the TATA box (TATAAAA/T). Shaded boxes of yellow denote the palindrome structure (TCGGTGCACCGA). Bold and blue texts denote the NF-1 (TTGGCA). The rectangle denotes polyadenylation signals (AATAAA). Bold and underline denotes the E2 binging motif (ACC-N6-GGT). A double underline denotes the series of TTTT. Wavy lines and shaded boxes denote the series of AAAAAA

1 材料与方法

1.1 材料 试验样品的采集来源于新疆南疆某养殖户患病牛，-20 ℃保存备用的50%甘油磷酸缓冲液中保存样品。

1.2 引物设计 通用引物MY11和MY09作为BPV基因分型扩增引物[3]，以NC001522和X02346为参考序列设计全基因扩增引物，引物序列如表1所示，所有引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 扩增引物Table 1 Specific primers

1.3 PCR反应体系 采用20 μL PCR扩增反应体系：模板DNA 1.0 μL，ddH2O 15.5 μL，2×LA Buffer 2.0 μL，引物Primer F(10 mmol/L)0.4 μL，引物Primer R(10 mmol/L)0.4 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s；54 ℃退火45 s；72 ℃每kb延伸1 min；32个循环，72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，确定扩增片段大小。

1.4 PCR产物纯化回收测序 取PCR切胶回收产物，参照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明书纯化回收PCR产物，并送北京金诺锐杰基因科技有限公司测序。……