李承浩 秦树英 曾文婷 李观静 吕海莉 谢江 吴健敏*

（1. 广西壮族自治区兽医研究所 广西兽医生物技术重点实验室，广西 南宁 530001；2. 广西农业职业技术学院，广西 南宁 530006）

大肠埃希菌属于革兰阴性细菌，有数根鞭毛，没有芽胞，是埃希氏菌属代表菌，也叫大肠杆菌。大肠埃希菌广泛存在于自然环境中，同时也是条件致病菌[1]，某些致病性强的菌株被统称为致病性大肠埃希菌。根据其遗传性和临床症状可分为肠内致病性大肠埃希菌、肠外致病性大肠埃希菌和共生型大肠埃希菌3 个类型。其中肠外致病性大肠埃希菌（Ex⁃traintestinal pathogenic Escherichia coli, ExPEC）是一类能引起人和动物肠外组织感染的重要人畜共患病病原，可致使不同宿主发生脑膜炎、败血症、泌尿道感染和呼吸道感染[2]。它不仅可以引起猪、牛羊、禽等多种动物发病，造成养殖业严重经济损失，也给人类的健康造成潜在的威胁[3]，已引起公共卫生部门的高度关注。

目前研究发现，ExPEC 抗生素耐药性明显高于其他菌群，50%以上菌株属多重耐药菌株，因此，在兽医临床上检测ExPEC 分离菌株的药敏特性及耐药基因，对有针对性使用抗生素进行治疗具有重要意义。

1 材料

1.1 病料

广西南宁横县某养殖场发病仔猪。发病仔猪消瘦异常，有明显的拉稀；剖检发现仔猪肠系膜淋巴结肿大，肠壁变薄且有严重的胃肠鼓气；开颅发现脑膜充血，大脑充血出血明显。

1.2 试剂

营养肉汤、麦康凯琼脂培养基，购于北京陆桥技术股份有限公司；细菌微量生化管，细菌药敏纸片，购于杭州滨和微生物试剂有限公司；2×Es Taq Mas⁃terMix、电泳凝胶回收试剂盒购于北京康维世纪生物科技有限公司；DNA Ladder Marker 为TaKaRa 公司产品，5%山羊血琼脂培养基为本实验室制备。

1.3 试验动物

选取8 只健康的昆明鼠，体重约为20±5g，购于广西医科大学实验动物中心。

2 方法

2.1 细菌分离纯化

无菌取肝脏、脾脏、脑及肠胃内容物分别划线接种于血琼脂培养基和麦康凯培琼脂养基上，倒置于37℃温室培养24h，观察细菌生长形态和菌落颜色，挑取形态特征一致的单个菌落划线进行纯化培养，再挑取单个菌落进行革兰染色、镜检。

2.2 生化试验

将分离纯化后的菌株按照操作说明书接种于硝酸盐、硫化氢、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、枸橼酸盐、尿素、V-P 试验等细菌微量生化管，置于37℃温室培养24h，观察并记录生化反应结果，依据伯杰细菌鉴定手册判定细菌生化鉴定结果[4]。

2.3 细菌16SrDNA PCR扩增及序列分析

按照常规方法提取该菌株的核酸基因组，并以此为模板，使用16SrDNA 基因的通用引物进PCR扩增，参照文献[5]合成引物:PF:5′-AGAGTTTGATCAT⁃GGCT-CAG-3′；PR:5′-GTGTGACGGGCGGTGTG⁃TAC-3′，产物送由生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因测序，测序结果在NCBI数据库中进行同源性比对。

2.4 药敏试验及耐药基因筛查

无菌操作将菌液涂布至血琼脂培养基上并均匀的贴上药敏纸片，药敏试验结果参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）颁布的标准进行判断[6]。

参照文献[5]中的方法设计合成四环素类（tetB、tetG、CatI）、大环内酯类（ermA、ermC）、氨基糖苷类（aadA、APH3、ACC（3））、头孢菌素类（Acrb、norA）、磺胺类（SulⅢ）、β-内酰胺类（mecA）、喹诺酮类（ge⁃lA）、氯霉素类（CmlA）等8 大类共15 个耐药基因进行PCR扩增，用以筛查该菌携带的耐药基因的情况。

2.5 分离菌株主要毒力基因的扩增

根据已有的文献报道，合成粘附素类（papC、fimC）、血清类（iss、ompA、cva/cvi）、铁转运系统类（fyuA、iucD）、保护素（kspM）等大肠埃希菌毒力基因，引物序列见表1，由广州华大基因科技股份有限公司合成。

2.6 小鼠致病性试验

将分离菌株接种普通营养肉汤，37℃恒温箱培养24h后，以不同梯度稀释菌液并均匀的涂布在血琼脂培养基上，通过细菌计数后得知菌液浓度约为2×10-8CFU/mL。将8 只健康昆明鼠随机均分为两组，试验组每只昆明鼠通过腹腔注射菌液0.1mL，对照组每只昆明鼠通过腹腔注射营养肉汤0.1mL，观察并记录试验昆明鼠发病死亡情况。

3 结果与分析

3.1 细菌分离纯化及镜检结果

结果在肝脏、脾脏、脑内以及胃肠内容物中均分离到细菌。其中脑内分离菌疑似大肠埃希菌，该菌在血琼脂培养基上长出灰白色、四周整齐中间稍微凸起、湿润且光滑的中等大小菌落；在麦康凯培养基上长出如图1所示的桃红色、四周整齐中间凸起、圆形且湿润的菌落。营养肉汤均出现浑浊。挑取单个菌落及营养肉汤培养物进行涂片、革兰染色、镜检，可见该菌株为排列不规则、短杆状、没有芽孢，革兰染色为阴性菌，见图2。

图1 分离菌在麦康凯培养基上的生长形态

图2 分离菌革兰染色观察图片（100×）

3.2 生化特性鉴定

将纯化后的分离菌株分别进行各项生化检测，结果见表2。由表2 可看出，分离菌可以发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖；硫化氢、硝酸盐、枸橼酸盐试验呈阳性，不分解尿素，V-P 试验和吲哚试验呈阴性。该试验结果与伯杰细菌鉴定手册中的大肠埃希菌生化鉴定结果一致，结果可初步鉴定分离菌株为大肠埃希菌。

表2 细菌生化试验结果

3.3 16SrDNA序列扩增及序列比对结果

以分离菌株DNA为模板，采用16SrDNA通用引物进行PCR 扩增，结果可扩增出约1500bp 的条带，将该条带切胶、回收后，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果在NCBI 数据库中进行序列比对，比对结果表明，分离菌与大肠埃希菌的同源性高达99.33%，进一步证明分离菌株为大肠埃希菌。

3.4 药敏试验及耐药基因筛查结果

3.4.1 药敏试验结果 分离菌药敏试验结果见表3。由表3 可见该分离菌株对头孢西叮、庆大霉素药物极度敏感，对新霉素、米诺环素、妥布霉素、氨曲南等药物高度敏感，对氨苄西林、磺胺异恶唑、左氟沙星、链霉素、四环素、乙酰螺旋霉素等药物耐药，该菌株为一种多重耐药菌株。

注：抑菌圈直径＞20mm为极敏；15 mm≤抑菌圈直径≤20 mm为高敏；10≤抑菌圈直径＜15mm为中敏；抑菌圈直径＜10mm为低敏；无抑菌圈为不敏感。

3.4.2 药基因筛查结果 由图3 可以看出，分离菌株可通过PCR扩增出与aadA、SulⅢ片段大小相对应的目的条带，说明该分离菌带有addA、SulⅢ耐药基因，与药敏试验结果基本一致。

图3 耐药基因检测结果

3.5 分离菌株主要毒力基因的扩增结果

毒力基因扩增结果见图4，由图4 可以看出，分离菌株可通过PCR 扩增出与iucD、papC、fyuA、iss、kspM片段大小相对应的目的条带，说明该分离菌带有iucD、papC、fyuA、iss、kspM毒力基因。

图4 毒力基因检测结果

3.6 小鼠致病性试验结果

攻毒18h 后，试验组4 只昆明鼠全部死亡，对照组4只昆明鼠均健康存活。试验组昆明鼠病死前出现精神沉郁、食欲减退、容易昏睡等。剖解死亡昆明鼠可见肝脏肿大并伴有点状坏死、肺脏有出血点、胃肠鼓气伴有血，肠道内充满黄色稀便、脑充血明显。从死亡昆明鼠体内分离菌经生化试验和PCR 检测与分离菌株一致，同为大肠埃希菌。

4 讨论

细菌携带的毒力基因和耐药基因与菌株的致病性和耐药性有较为直接的关系,因此，检测分离菌株的毒力基因和耐药基因对于评估该病原菌的致病性及耐药性以及防控策略的制定有意义。近几年来，养殖业发展迅速，但滥用抗生素的情况也屡见不鲜，导致耐药菌株不断出现。本试验分离菌株虽为自然界最为常见的大肠埃希菌，却对大多数兽医临床上常用的抗生素产生耐药，这与临床上药物治疗效果不佳有很大关系。

毒力岛(pathogenicity island)指细菌染色体上编码毒力相关基因的特殊区域,是某些细菌在进化过程中适应环境变化而获得的毒力基因。其中强毒力岛(HPI) , 即耶尔森菌毒力岛的主要结构基因是FyuA、irp1、irp2；基因irp2 为标志基因，与耶尔森氏菌的铁摄取能力有关，基因FyuA 与耶尔森氏菌的鼠疫菌素敏感性有关[7]。荚膜是E.coli 引起肠道外感染的重要因素。当敲除了与荚膜多糖输出相关的kpsM 基因后，猪脑炎PCN033 突变株的粘附、抗吞噬作用和抗补体介导的血清杀菌能力均显著下降[8]。本次试验利用PCR 技术对分离菌进行了papC、fimC、iss25、ompA、cva/cvi、fyuA、iucD、kspM 毒力基因的检测，结果存在有papC、iss、fyuA、iucD、kspM这五个毒力基因，可以合理推测认为该菌株是致病力较强的菌特别是kspM基因，是引起脑炎的主要因素之一。本试验分离的大肠埃希菌存在kspM基因，是引起猪发生脑炎导致死亡的重要原因。

本试验对该分离菌进行了药敏试验、动物致病试验、耐药基因及毒力基因的PCR 扩增，均证实了该分离菌具有较强的致病性，存在多重耐药。在治疗时应选用敏感药物进行治疗。