罗娅婷，崔现亮，熊雪娟，张国忠，李学玲

1.云南省高校亚热带药用食用生物资源开发与利用重点实验室，普洱学院 生物与化学学院，云南 普洱 665000；2.云南农业大学，云南 昆明 650000

咖啡是世界上的主要饮品之一[1]。咖啡加工一般采用湿法加工，在这一过程中会产生大量的咖啡果皮废弃物[2]。据Emaille 和Saenger 研究报道指出，单咖啡果皮就约占成熟鲜果的43～50%，每1 吨干咖啡豆生产约产生1 吨咖啡果皮，而在半湿和湿加工过程中，咖啡果皮的量可达2 吨以上[3-4]。这些咖啡皮大多是随意丢弃的，不但对环境造成污染还造成了原料的浪费[5]。

咖啡果皮中富含许多有益成分如咖啡因[6]，花青素[5]，原花青素[7]，膳食纤维，粗蛋白和各种矿物质等[8]。其中原花青素（Oligomeric proantho-cyanidins，OPC）在医疗保健，食品和化妆领域都有不同的应用[9-10]。国内对于原花青素的提取方法有很多，主要有：溶剂浸提[11]，超声波提取、微波辅助提取等方法[11-12]，溶剂提取是一种较为简便的方法，多利用乙醇、甲醇、水等溶剂用作提取剂，但对于咖啡果皮中原花青素的提取优化工艺国内外均未见报道。

随着咖啡产量的提高，果皮废弃物数量也随之增加，咖啡果皮的开发利用是一个急需解决的问题[5]。通过响应面分析法利用合理的试验设计[13]，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最佳工艺参数，能以用较少的试验数量和时间对试验进行全面研究，能在更为经济的试验次数下得到精确的统计结果，并对因素及其交互作用的影响也可以进行评价[14]。从而可以得到咖啡果果皮的优化提取工艺，为咖啡果皮的开发及综合利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

新鲜咖啡果：采摘于思茅区南屏镇大开河村（海拔：1 023m；N22°35′35″；E101°0′47″），思茅区南屏镇冬瓜岭某种植基地（海拔：1 098m；N22°65′72″；E101°1′13″），普义乡普治村农户家的咖啡地（海拔1 209m；N23°3′23″；E101°23′37″）三个地方，品种均为“卡蒂姆”系列，采样遵循代表性，均匀性，随机性原则，采取的每个样品不低于2Kg。采回的鲜豆及时剥皮处理，避免发酵。

儿茶素标准品：合肥博美生物科技有限公司

香草醛：天津市光复精细化工研究所

甲醇、乙醇、氢氧化钠、硫酸均为分析纯

30%硫酸甲醇配制：取350ml 甲醇，倒入烧杯，然后缓慢加入98%的浓硫酸，边加边搅拌。

3%香草醛甲醇配制：取30g 香草醛粉末置于1000ml 甲醇溶液中，不断搅拌直至溶解。

1.2 仪器设备

721G-100 可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；YP-5002 电子天平：常州万泰天平仪器有限公司；FA2004G 电子天平：常州万得天平仪器有限公司；智能光照培养箱PGX-150；江苏同君科技仪器有限公司；HHA-11-2 电热恒温水浴锅：江苏同君科技仪器有限公司；PHS-3CPH 计：上海仪电科学仪器股份有限公司；CS-100A 型高速多功能粉碎机。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的选择及确定

试验样品制备：将新鲜和晒干咖啡果按未熟、欠熟、成熟、过熟分别研磨或粉碎后取0.2g，以料液比1：70 加入80%乙醇，在70℃下水浴提取50min，过滤，滤液定容至50ml，待用。

咖啡果皮样品中原花青素含量的测定（硫酸-香草醛法[16]）：(1)空白调零： 0.5ml 蒸馏水+30g/L 香草醛甲醇溶液2.5ml+30%硫酸甲醇溶液2.5ml 于10ml 试管中, 在30℃黑暗条件下反应15min[18]。（2）咖啡果皮提取液吸光值测定：0.5ml 咖啡果皮提取液样液+30g/L 香草醛甲醇溶液2.5ml+30% 硫酸甲醇溶液2.5ml 于10ml 试管中，30℃黑暗条件下反应15min 后，在500nm 处测定吸光值A1[15-17]。（3）去除颜色误差：在样品提取液中存在的色素在500nm处有吸收，消除样品本底与颜色带来的误差[17]，操作为：0.5ml 咖啡果皮提液样液+甲醇溶液2.5ml+30%硫酸甲醇溶液2.5ml 于10ml 试管中，30℃黑暗条件下反应15min 后，在波长500nm 处测定吸光值A11，原花青素的吸光值为A=A1-A11，并根据原花青素标准曲线计算咖啡果皮中原花青素的含量[17]。

1.3.2 咖啡果原花青素提取的实验设计

1.3.2.1 咖啡果皮中原花青素提取率的单因素试验

在20ml 试管中取0.2g 咖啡皮样品粉末，加入一定体积的提取溶剂，在一定温度水浴中提取一定时间，过滤，用提取溶剂定容于50ml 容量瓶中，取0.5ml 样品溶液，按照标准曲线绘制的操作方法操作，测量光吸收值并计算提取率。研究了不同提取剂及其浓度、固液比、提取时间、提取温度和酸碱度对咖啡果皮中原花青素提取率的影响[17-18]。

1.3.2.2 响应面优化实验设计

在进行了单因素对咖啡果皮中原花青提取率影响实验并分析了结果的基础上，选取四个对咖啡果皮原花青素提取率影响最大的自变量。根据Box-Behnken 中心组合实验的设计原理，采用四因素（取提取剂浓度、提取时间、提取温度、料液比）三水平的响应曲面分析法[19]，每组重复3 次，以咖啡果皮中原花青素的提取率为响应值，采用响应面法分析法优化咖啡果皮中原花青素的提取条件，使用Design-expert10 软件进行回归分析。设计如下：

表1 响应面实验因子设计

2 结果与分析

2.1 不同处理下咖啡果皮原材料原花青素的提取率

从图1 的可得，在20ml 试管中加入0.2g 不同处理（鲜果和干果）的咖啡果皮样品，其他提取条件（即提取溶剂：选用1：70 的80%乙醇溶液，在70℃水浴锅中提取50min）相同，各个成熟度都不超过3.5mg/g，干燥研磨后咖啡果皮中原花青素含量明显增高到21.5mg/g，鲜果和干果各个成熟度差异显著。因此，选择干燥的咖啡果皮粉末作为原材料。

2.2 单因素实验

2.2.1 不同提取溶剂及浓度对咖啡果皮原花青素提取率的影响

由图2 分析可得，料液比为1∶50（g/ml），在70℃水浴中提取50min，分别加入不同浓度(40%～100%)的乙醇、甲醇和蒸馏水浸提，提取液浓度为40%，70%～100%时，甲醇比乙醇提取率高，但提取液浓度在50%～70%时乙醇提取率高，且在70%处达到峰值，提取率最高，水的提取率明显比甲醇和乙醇的低，可能是原花青素非极性部分较大的原因。

2.2.2 料液比不同对咖啡果皮原花青素提取率的影响

由图3 分析可得，加入提取剂70%乙醇溶液按不同料液比（1：20～1：100 单位：g/ml），在70℃水浴锅中提取50min，咖啡果皮中原花青素提取率随着提取溶剂的增加而显著增加当料液比在1：20～1：60范围内，由于提取液体积的增加和原花青素氧化速率的加快，导致原花青素提取速率的降低[19]，所以咖啡过果皮中原花青素的提取率在1：60 时有最大提取率，然后随料液比的增大而逐渐降低。

2.2.3 提取温度不同对咖啡果皮原花青素提取率的影响

由上图4 分析可得，加入70%乙醇溶液，按固液比例为1∶60(g/ml)，分别按不同温度(40℃～100℃)的水浴锅中提取50min，提取温度在40℃～90℃范围内，当温度增高时，咖啡果皮中原花青素的提取率随着增加。在90℃时，咖啡果皮中原花青素的提取率最大，随着温度的进一步升高时，咖啡果皮中原花青素的提取率下降。

2.2.4 提取时间不同对咖啡果皮原花青素提取率的影响

由图5 分析可得，加入浓度为70%的乙醇溶液提取剂，比例为1：60(g/ml)，在90℃下水浴锅中分别提取不同时间（30～90min）后，咖啡果皮中原花青素的提取率最大时提取时间为40min 时，，而后开始下降。这可能是由于提取时间较短时，咖啡果皮中原花青素来不及溶出[20]，时间过长咖啡果皮中原花青素又因为提取时间过长部分结构会发生变化，杂质成分也随之增加[21]。

2.2.5 pH 不同对咖啡果皮原花青素提取率的影响

从图6 可得，加入70%乙醇溶液(PH6)，比例为1：60(g/ml)，用0.1mol/L 硫酸调节pH（2～5），用氢氧化钠溶液调节PH（7～12），90℃水浴锅中提取40min，在pH 为2～6(不加酸与碱时，pH 为6），原花青素提取率在pH 为6 时最大，随后，随pH 的增大而减小，可能是由于原花青素在氢氧化钠的作用下，结构遭到破坏。pH 过低或过高都不利于原花青素的提取，pH 过低时可能导致原花青素在提取过程中水解,所以响应面实验不考虑pH 这个因素。

2.3 响应面优化实验分析

2.3.1 模型的建立与显著性分析

在进行了咖啡果皮中原花青提取的单因素实验的并进行分析后的基础上，选取对原花青素提取量有较为明显影响的四个因子即提取温度、乙醇浓度、料液比、提取时间，以咖啡果皮原花青素提取率为响应值，再进行响应面分析实验。

表2 响应面法分析试验设计和结果

7 1 -1 0 0 22.62 23.01 8 0 0 0 0 25.41 23.30 9 0 -1 1 0 21.51 22.27 10 1 1 0 0 25.15 25.10 11 0 1 0 -1 15.08 22.22 12 -1 0 -1 0 15.54 18.07 13 0 0 0 0 21.51 23.30 14 -1 -1 0 0 24.11 23.30 15 0 1 -1 0 16.97 16.27 16 1 0 0 1 12.68 22.43 17 0 0 1 -1 23.27 23.09 18 1 0 0 -1 27.88 26.45 19 0 0 -1 1 21.38 16.41 20 -1 0 0 1 19.95 22.88 21 -1 1 0 0 24.76 20.12 22 0 -1 -1 0 20.67 20.00 23 1 0 -1 0 16.97 17.43 24 0 0 -1 -1 20.67 20.62 25 0 1 0 1 25.02 24.53 26 -1 0 0 -1 22.68 21.31 27 0 0 0 0 25.28 23.30 28 0 0 0 0 22.68 23.30 29 0 -1 0 1 22.49 21.54

对上表中数据根据软件Design-Expert 10.0 进行多元回归拟合，得到目标函数为咖啡果皮中原花青素提取量的回归方程：

乙醇浓度、固液比、提取温度、提取时间在设计中均经量纲1 线性编码处理,因此,方程中各项系数绝对值的大小直接反映了各因素对指标值的影响程度,系数的正负反映了影响的方向[20]。

表3 方差分析

由表2 中方差分析可得，在该咖啡果皮中原花青素提取的数学模型中值为0.0015，小于0.01,所以该方程的模型达到了高度显著的水平，且在失拟试验中，由数据可知其结果表现为不显著，此时值为0.7499，表明未知因素对测试结果影响不大。在该回归模型模型中其拟合度比较好，因为其总决定系数R2=0.8465，超过84%的实验数据变异性可用此模型图解释，并且决定调整系数R2adj=0.6931 说明该模型可以较好地预测新数据。

表4 显著性检验结果

由表4 可知：（1）在乙醇浓度、提取温度、固液比和时间4 个因子中，提取温度和提取剂浓度对咖啡果皮中原花青素的提取率有极显著影响，其余各项对咖啡果皮中原花青素的提取率表现为不显著影响；（2）在交互项中固液比与提取时间的偏回归系数极显著，说明提取过程中提取时间与料液比的交互项对咖啡果皮中原花青素的提取率有显著影响；其余交互项对咖啡果皮中原花青素的提取率表现为不显著影响；（3）由于二次项系数中X32的偏回归系数达高度显著水平，表明实验因素对咖啡果皮中原花青素提取率的影响并非是简单的线性关系，二次项和交互项也都会对咖啡果皮中原花青素提取率有显著影响[21-22]。

2.3.2 单因素交互项对原花青素提取率的影响

通过软件绘制咖啡果皮原花青素提取率和自变量关系的等高线及其对应响应面图，从中可以清晰的看出：等高线图能够体现最优条件下各因子的取值以及各因子之间的交互作用，等高线图越圆，这两因素交互作用越不显著，而椭圆形则表示两因素交互作用显著[21，23]。

图7 反应了提取温度C 和提取时间D 处于一定状态过程中，当料液比不变时，咖啡果皮中原花青素提取率也随着乙醇浓度增高而缓慢上升，但并不显著；固定乙醇浓度，咖啡果皮中原花青素提取率随着料液比的增大，其并没有显著地增加；说明两因素交互不明显。

通过图8 分析可得，在此过程中，提取过程中温度不变时，咖啡果皮中原花青素提取率随着乙醇浓度并没有太明显的变化；乙醇浓度固定不变时，随着温度的上升咖啡果皮中原花青素提取率随之变化较小，说明乙醇浓度与提取温度的交互作用对咖啡果皮中原花青素的提取率影响不大。

由图9 的3D 图可以看出，提取时间不变咖啡果皮中原花青素的提取率随着乙醇浓度的变化并没有显著变化，说明乙醇浓度和提取时间的交互作用对咖啡果皮中原花青素提取率影响不大。

图10 反映了，当乙醇浓度A 与提取时间D 在咖啡果皮中原花青素的提取过程中不变时，咖啡果皮中原花青素的提取中提取温度C 与料液比B 的交互作用对其提取率的影响。咖啡果皮中原花青素提取中提取温度不变时，随着固液比的增大，咖啡果皮中原花青素的提取率变化不大；当料液比不变时，随着温度的上升咖啡果皮中原花青素提取率缓慢上升而后减小；两因素交互不显著。

图11 反映了在咖啡果皮中原花青素的提取过程中当乙醇浓度A 和提取温度C 不变时，咖啡果皮中原花青素提取中料液比B 和提取时间D 的交互作用对其提取率的影响。料液比在提取过程中不变时，咖啡果皮中原花青素提取率随着提取时间的延长而提高；提取过程中提取时间取一定值时，咖啡果皮中原花青素的提取率随着固液比的增大而先减后增，两因素交互作用明显，从图可得咖啡果皮中原花青素提取率在料液比11～13 之间有最大值。

图12 反映了在咖啡果皮中原花青素提取过程中乙醇浓度A 和料液比B 处于一定状态不变时，提取温度C 和提取时间D 的交互作用对咖啡果皮中原花青素提取率的影响。由图12 中的3D 图中看出，提取时间取一定值不变时，随着提取温度的上升咖啡果皮中原花青素的提取率而先升后降；当提取温度不变时，咖啡果皮中原花青素的提取率随着提取时间的延长并无明显变化；两因素交对咖啡果皮中原花青素的提取率交互作用不显著。

3 结果

通过Design Expert10.0 软件确定的咖啡果皮原花青素提取最优提取工艺为：提取溶剂及其浓度为80%的乙醇，固液比为1：69.97，提取温度及时间为100℃下提取50min，理论提取率为30.099mg/g。根据验证实验测得咖啡果皮原花青素提取率实际值为30.086mg/g, 通过计算可得咖啡果皮原花青素提取率理论值与实际值误差仅为0.044%，该模型能够较好的预测实际提取率，确定最佳提取工艺。