4 种蕨类植物中多糖、总黄酮、绿原酸含量的测定及比较研究

2020-07-30樊竹青杨文丽

普洱学院学报 2020年3期

樊竹青，杨文丽，谢勇，李丽

普洱学院生物与化学学院，云南普洱 665000

蕨类植物现存约12 000 种，我国有61 科，223属，约2 600 种，其中可供药用的约300 余种，主要分布在华南及西南地区。云南是中国蕨类植物资源最丰富的地区之一，约有1 500 种，特有种类达200余种[1]，其西南部的热带雨林中，广泛分布着多种具有药用价值的蕨类植物，尚待研究和开发。

长叶实蕨为实蕨科（Bolbitidaceae）植物，根茎扁平长条状，叶片形状多样。有清热解毒、敛肺止咳、止血的功效，可治疗咳嗽、吐血、痢疾、烧烫伤、跌打损伤、蛇咬伤、出血症。

蕨类植物所表现出的功效与其所含的生物活性物质是密不可分的，在蕨类植物的研究中，有关云南西南部蕨类活性成分的报导不多，对绿原酸的研究还是空白。选择西双版纳热带雨林中长叶实蕨、卷柏、剑叶凤尾蕨、半边旗为实验材料，测定其多糖、总黄酮及绿原酸含量，为药用蕨类植物的开发利用提供实验依据。

1 材料及方法

1.1 实验材料

采自云南省西双版纳州勐腊县勐伦热带雨林中。将采集好的长叶实蕨、半边旗、凤尾蕨、卷柏迅速洗净、烘干、研碎后用袋子密封备用。

1.2 主要设备

岛津UV-2550 型紫外可见分光光度计、JW-100S 型超声波清洗机、G80F23N1P-M8（S0）型微波炉。

1.3 多糖含量的测定

分别称取4 种蕨类植物干粉各两份（1.0000g/份），按1∶30 加蒸馏水，充分浸泡，放入到微波炉中，中火处理，计时15min；然后将样品放于80℃水浴中提取1h，定时搅拌；完成后离心，获取上清液；放在60℃水浴中进行浓缩，体积减至20～25mL 时即可。向浓缩液中加入无水乙醇，二者体积比为3：1，得到的混合液后进行离心，弃上清液，留取沉淀物；沉淀物中加入3%三氯乙酸脱蛋白，放入冷冻干燥箱进行冷冻干燥，所获得产物即为多糖粗品。加入蒸馏水，使其充分溶解，再次定容至50mL，备用。

采用苯酚-硫酸法来测多糖含量。以无水葡萄糖为标准样品（蒸馏水为溶剂），试剂空白作为参比，在最大吸收波长490nm 处测定吸光度值。以吸光度值作为纵坐标，葡萄糖浓度作为横坐标，绘制标准曲线。按上述方法测样品的吸光度值，根据标准曲线计算出多糖含量。

1.4 总黄酮含量测定

分别称取4 种蕨类植物干粉各两份（1.0000g/份）放入锥形瓶中，加入30 倍体积60%乙醇溶液，用超声提取法，超声设置功率为75W，温度60℃、30min 进行提取，对提取液进行抽滤，获得滤液，备用。

以芦丁标准品来配制芦丁标准溶液（60%乙醇为溶剂），试剂空白作为参比，在最大吸收波长520nm 处测定吸光度值。以吸光度值作为纵坐标，芦丁浓度作为横坐标，绘制标准曲线。按上述方法测样品的吸光度值，根据标准曲线计算出总黄酮含量。

1.5 绿原酸含量测定

分别称取4 种蕨类植物干粉各两份（1.0000g/份）放入锥形瓶中，加入15 倍体积95%乙醇，利用超声提取法，超声设置功率为60W，温度50 ℃、40min 进行提取，提取液进行抽滤，滤液备用。

以绿原酸标准品配制标准溶液（95%乙醇为溶剂）试剂空白作为参比，在最大吸收波长330nm 处测定吸光度值，以吸光度值作为纵坐标，绿原酸浓度作为横坐标，绘制标准曲线。

2 研究结果

2.1 多糖含量测定结果

用紫外可见分光光度计于490nm 处测定各葡萄糖标准溶液的吸光度值（A），然后以吸光度值（A）为纵坐标，以葡萄糖标准溶液的浓度(μg/mL)为横坐标，回归方程y=0.0064x+0.0048，相关系数R2=0.9993，表明葡萄糖在0-100 μg/mL 浓度范围内呈良好的线性关系。

表1 多糖含量测定结果

4 种蕨类植物多糖含量由高到低顺序依次为半边旗＞剑叶凤尾蕨＞卷柏＞长叶实蕨，含量最高的半边旗或比含量最低的长叶实蕨高出了1.5072%，这个差值甚至高于卷柏的含量。较高的两个种均属于凤尾蕨属。

2.2 黄酮含量测定结果

用紫外可见分光光度计于520nm 处测定各芦丁标准溶液的吸光度值（A），然后以吸光度值（A）为纵坐标，以芦丁标准溶液的浓度(μg/mL)为横坐标，回归曲线方程y=0.0124x-0.0104，相关系数=0.9991，表明芦丁在0～48μg/mL 浓度范围内呈良好的线性关系。

表2 总黄酮含量测定结果

黄酮类化合物是药用植物研究中关注度很高的活性成分。4 种蕨黄酮含量的差异不如多糖明显，含量由高到低依次为长叶实蕨＞卷柏＞半边旗＞剑叶凤尾蕨，与多糖含量的排序几乎相反，长叶实蕨的多糖含量最低但黄酮含量却最高，多糖含量占优势的半边旗和叶凤尾蕨的黄酮含量却较低。

2.3 绿原酸含量的测定结果

用紫外分光光度计于330nm 处测定各绿原酸标准溶液的吸光度值（A），然后以吸光度值（A）为纵坐标，以绿原酸标准溶液浓度(μg/mL)为横坐标，回归曲线方程y=0.0520x-0.0026，相关系数=0.9993，表明绿原酸在0～16μg/mL 浓度范围内呈良好的线性关系。

表3 绿原酸含量测定结果

绿原酸有多种生物活性，通常认为是植物体内最重要的抗菌、抗病毒成分。4 种蕨的绿原酸含量依次为半边旗＞卷柏＞长叶实蕨＞剑叶凤尾蕨，其中半边旗和卷柏的绿原酸含量略占优势，但总体差异不大。

把4 种蕨类植物的多糖、总黄酮及绿原酸含量进行比较（见图1），看它们在不同植物种内的变化趋势。

从图中可以看出，多糖含量相对较高且不同种间的差异明显，半边旗的多糖显著高于其它3 个种；总黄酮和绿原酸的含量在4 种蕨类植物中则比较接近，种间差异很小。

3 讨论

许柑叶对福州市高盖山公园的8 种蕨包括芒萁、乌蕨、蕨、蜈蚣蕨、井栏边蕨、金粉蕨、扇叶铁线蕨、华南毛蕨的多糖做过测定，含量依次为5.49%、0.64%、1.73%、3.83%、1.22%、3.46%、4.76%、1.21%[4]；林勤等对福建漳州芝山公园半边旗多糖的测定结果为2.18%[5]，实验中4 种蕨的多糖含量在1.2039%～2.7111%之间。在以上共涉及12个种的结果中，不同种蕨类植物的多糖含量差异较明显，含量最高的芒萁可以达到5.49%，最低的乌蕨仅为0.64%，半边旗和剑叶凤尾蕨的含量处于中间位置。

在总黄酮的含量上，苏云山对采自红河、昭通、文山等地的15 个属共32 个种的蕨类植物做过测定，结果狗脊蕨属的狗脊蕨和单芽狗脊的分别达到了8.70%和8.38%，是32 个种中含量最高的[1]，其余多数种在1%～5%之间，但云南凤尾蕨仅为0.50%；梁晓华对采自哀牢山国家自然保护区的13 种蕨类植物总黄酮含量也做过测定，大多数蕨的总黄酮含量在1%～4%之间，但大叶假冷蕨叶片的总黄酮含量达到了令人惊讶的10.375%[6]，而笔管草却仅为0.1%；傅玉萍对广东湛江寸金产的半边旗的总黄酮含量为0.78%[7]。实验中所测的4 种蕨总黄酮含量在0.2342%～0.3837%之间，处于中下水平。总体来看，总黄酮的含量也与多糖类似，也有较明显的种属差异性。

分析不同文献对多糖和黄酮的测定结果，发现出现明显差异的原因，除了种的因素外，采集地点、采集时间、植物的发育状态、提取部位、提取及测定的方法和步骤等均可能对测定结果产生影响，需要重视这些影响因素带来的数据变化。

绿原酸是药用植物中另一种重要的生物活性物质，但它的化学性质不稳定，在提取过程中易发生异构化，受热、见光易氧化，这给绿原酸的测定增大了难度。有关蕨类植物的绿原酸含量的报导很少，从测定的结果来看，4 种蕨的含量在0.1113%～0.1519%之间，与其它药用植物金银花、山银花相比，并没有优势，但鉴于蕨类植物绿原酸含量方面的资料太少，还有必要展开进一步研究。

实验室在前期用4 种蕨的水提取液进行了抑菌实验，结果发现，当以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉作为指示菌时，4 种蕨类植物的水提取物可抑制除黑曲霉以外其余4 种微生物的生长，并以半边旗对大肠杆菌的抑制作用最为明显，并表现出提取液浓度与抑菌性的正相关关系，但这种抑菌活性是否与上述3 种活性成分呈正相关关系，是后期将要继续的工作。