张亚 杨炳

(1.遵义医科大学附属医院妇产科，贵州 遵义563000;2.贵州省肿瘤医院妇瘤外科，贵州 贵阳 550001)

腹腔粘连在临床上较为常见,是腹部手术后的常见并发症，其发生率约为67%～93%[1]。尽管大多数腹腔粘连的症状不明显，但粘连可以导致不孕、慢性盆腹腔痛及肠梗阻，并增加再次手术的难度[2]。不仅如此，还可以降低肿瘤细胞减灭术后的腹腔化疗效果甚至是化疗失败。对于晚期盆腹腔恶性肿瘤如卵巢癌、输卵管癌及其它腹腔癌症而言，尽管肿瘤细胞减灭术为后续的腹腔化疗创造了有利条件，但该类手术却导致了广泛的腹膜缺损，继而形成广泛的腹腔粘连，不仅影响了化疗药物在腹腔内的分布，而且还降低了腹腔化疗的效果甚至是化疗失败[3]。腹腔化疗常用的顺铂、卡铂等抗癌药物因分子量小而易于通过腹膜被快速吸收从而削弱了腹腔给药的优势。因此，如何预防术后的腹腔粘连从而增加化疗效果是一个值得探究的问题。我们此前的研究已经证实PECE水凝胶具有良好的生物相容性、生物可吸收性及预防腹腔粘连的的特性，其在低温(10℃)时呈液态，易于和药物混合，而在37℃左右则呈凝胶状，易从注射器中挤出并能够不受空间限制地粘附到腹膜创面上。本实验将卡铂-PECE水凝胶应用于动物模型以了解装载卡铂的PECE水凝胶是否仍具有预防腹腔粘连的防粘效果。从而为肿瘤细胞减灭术后预防腹腔粘连的治疗模式提供理论依据。

1 材 料

1.1实验动物 Wistar雌性大鼠重约240～260 g。所有大鼠在使用前均经过正规检疫。对照组：卡铂组：雌性大鼠重约240～260 g 随机分配15只；治疗组：卡铂-PECE水凝胶组：雌性大鼠重约240～260 g 随机分配15只。

1.2主要药品及试剂 卡铂(Carboplatin)粉针剂购自齐鲁制药有限公司；聚乙二醇-聚己内酯-聚乙二醇(PEG-PCL-PEG,PECE)共聚物；Masson染色试剂。

1.3实验方法

1.3.1卡铂-PECE水凝胶的制备及电镜观察 25wt % PECE水凝胶的制备：称取一定量的PECE共聚物，加入生理盐水充分搅拌均匀并在75 ℃温度下溶解，配制成浓度为25wt %水凝胶，4 ℃保存备用。卡铂-PECE水凝胶的制备：低温时25wt % PECE水凝胶呈流动的溶胶态，加入一定量的卡铂并充分搅拌混匀配制成浓度为1 mg/mL的卡铂-PECE水凝胶。扫描电镜检测：将所制备的卡铂-PECE水凝胶(1 mg/mL)低压冻干72 h后，液氮淬断、喷金，SEM观察。

1.3.2卡铂-PECE凝胶抗粘疗效观察 大鼠腹壁缺损—盲肠摩擦模型的建立参考文献报道[4]进行。使用10%水合氯醛按每公斤体重(0.3 mL/100 g)进行麻醉，麻醉生效后大鼠取仰卧位，备皮、消毒后取腹部正中切口，逐层切开腹壁及腹膜，识别盲肠并用消毒干纱布摩擦盲肠浆膜层直至创面有点状出血以形成一面积约为3 cm2的浆膜缺损区域。然后将盲肠放回腹腔，用手术刀在右侧腹壁上制造一2 cm×3 cm大小的腹膜缺损，将两个创面并行排列，并用3/0丝线缝合以诱导粘连形成。按上述方法制作30只大鼠模型，随机分为卡铂组(60 mg/kg)和卡铂-PECE水凝胶组(60mg/kg)，各组15只。术后不同时间处死大鼠，按下述标准采用双盲法进行粘连评分[5]：0分：无粘连；1分：薄膜样粘连；2分：固定的局部粘连；3分：致密的累及多个脏器的粘连；4分：累及腹壁及内脏的致密粘连。为进一步了解卡铂-PECE水凝胶防粘作用的动力学，我们又制作了18只模型大鼠并用卡铂-PECE水凝胶处理创面并于术后1、3、5、7、9、12 d处死大鼠以观察有无腹腔粘连的形成、凝胶的降解吸收和创面的修复，同时探索其预防粘连的机制。

1.3.3组织学分析 处死大鼠后，剖视腹腔并进行肉眼观察，切取受伤的腹壁、盲肠以及与粘连相关的腹壁和盲肠。生理盐水清洗后修剪组织并固定于中性福尔马林缓冲液，48 h后脱水、石蜡包埋，制成病理切片，分别行Masson染色病检。此外，心、肝、脾、肺、肾、肠、胃等组织也一并行病检HE染色。HE染色：(1)切片在二甲苯中脱蜡10 min，脱蜡共两次；(2)移入100%、95%、85%、70%酒精，梯度酒精各为2～5 min，最后经蒸馏水转入染液；(3)苏木精染液染色5～15 min；(4)水洗玻片上多余染液，0.5%～1%盐酸酒精(70%酒精配制)分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10 s；(5)流水冲洗15～30 min，使细胞核呈蓝色；(6)蒸馏水短洗；(7)0.1%～0.5%伊红染液染色1～5 min；(8)依次经70%、85%、95%、100%酒精脱水，各级为2～3 min；(9)二甲苯透明(两次)，共约10 min；(10)封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。Masson染色：(1)常规脱蜡至水；(2)置Bouin液室温过夜，流水冲洗至黄色消失，然后用蒸馏水冲洗；(3)Ⅰ液5 min，蒸馏水冲洗；(4)Ⅱ液15 min，Ⅲ液5 min，蒸馏水冲洗；(5)1%冰乙酸溶液浸泡5 min；(6)无水乙醇5 min，自然干燥过夜，中性树胶封片；备观察。

1.3.4毒副作用观察 为了评估卡铂-PECE水凝胶治疗对大鼠可能引起的毒副反应，实验期间观察各组动物的生存状态，如有无厌食、腹泻、活动减少及腹壁切口愈合状况等。

1.4统计学方法 因治疗组及对照组的粘连评分并不符合正态分布，所以统计分析采用Mann-WhitneyU-tests和Fisher’sexacttest。所有统计分析中以P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1物理特性 粉末状卡铂与25wt %水凝胶混合后，低温时(10℃)呈流动的溶胶态，在37℃时呈凝胶态。将卡铂-PECE水凝胶低压冻干后行扫描电镜检查，可见水凝胶内有大量的微孔，这种结构允许药物分子进入凝胶骨架，将凝胶置于水中或凝胶结构降解时药物分子也可以从骨架中弥散出来。为动物实验所使用的卡铂-PECE水凝胶(1 mg/mL)。

2.2卡铂-PECE水凝胶的防粘效果 30只大鼠接受腹壁缺损—盲肠摩擦手术，并被随机分为两组，一组接受单纯的卡铂溶液治疗，另一组接受卡铂-PECE水凝胶治疗(图1B)。手术后15 d处死所有动物并进行腹腔粘连粘连评分。15只卡铂-PECE治疗的大鼠中，无粘连形成(P<0.001，P<0.01)。其中位粘连评分明显低于对照组(P<0.001)。全部卡铂-PECE凝胶治疗的壁层腹膜和脏层腹膜缺损完全恢复正常，腹腔中也未发现水凝胶残余物出现。

2.3防粘动力学观察 经过卡铂-PECE水凝胶处理的模型大鼠中仍未出现腹腔粘连。伴随着时间的延长，粘附于腹壁和盲肠创面的水凝胶分别于术后的3～5 d和5～7 d逐渐消失(图2A～C)。伴随着创面凝胶的消失，术后第3天腹腔内可见粘稠液体并逐渐增多，第5天达到高峰图2C)，又在随后的7 d内完全吸收(图2D)。伴随着水凝胶的降解和吸收，壁层腹膜和脏层腹膜创面分别于治疗后第5天和第9天愈合(图2C～E)，其外观在手术后第12天恢复正常(图2F)。

2.4腹膜创面修复过程中的病理观察 卡铂-PECE水凝胶治疗后第3天，可以看到壁层腹膜创面上覆盖一层水凝胶，伴炎细胞浸润及大量的核固缩的凋亡细胞，水凝胶下方可见极少量的散在的胶原蛋白沉积。治疗后第5天，主要有巨噬细胞和泡沫样巨噬细胞构成的炎性细胞层出现，该细胞层仍含有大量的凋亡细胞。在随后的7 d内，富含胶原和成纤维母细胞的结构代替了炎性细胞层，该层结构内依然有大量的凋亡细胞，并于术后第12天在该层结构的上方见到完整间皮细胞层。见图3。

图3 腹膜创面修复过程中的病理观察

2.5毒副作用观察 对于腹腔粘连模型大鼠而言，为了观察卡铂-PECE凝胶治疗是否增强了卡铂对重要脏器明显的毒副作用，切取大鼠心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、输卵管等脏器并制成病理切片，HE染色后在光学显微镜下观察，没有发现明显的异常改变。见图4。

注：A～H分别表示卡铂-PECE凝胶组大鼠心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠及输卵管组织的HE染色图，未发现明显的异常改变。图4 HE染色图

3 讨 论

腹腔粘连是手术对腹膜损伤不可避免的并发症。创伤启动了炎症反应，伴随着富含纤维蛋白的渗出增多，在腹膜创面形成纤维蛋白性基质性粘连。如果纤溶酶级联反应功能下降，成纤维母细胞侵入纤维素样粘连并分泌胶原蛋白，最终导致牢固的纤维化粘连的形成对于腹腔粘连的药物治疗而言，而纤溶酶制剂有增加出血的危险，抗炎药却延迟了腹膜创面的愈合[6]。因此，为了预防粘连形成，专家推荐术后使用防粘屏障[7]，防粘屏障从形态上分为粘稠聚合溶液、预形成的固体膜片和原位交联水凝胶等，使用时将它们覆盖在受累的组织器官表面以减少相邻器官的接触。对于聚合溶液而言，因其在所应用部位的滞留时间较为短暂而疗效不佳[8]。对固体膜片而言，应用时需将膜片置放于腹膜创面并需缝合固定及彻底止血，不仅增加了手术难度，而且由于缝线反应还增加了腹腔粘连的机会[9]。此外，膜片长时间的腹腔滞留(>31 d)可能会对健康造成潜在危害。因此，由于这些缺陷而使上述防粘剂的临床应用受到限制。目前尚未找到理想而有效的药物。理想的防粘屏障不仅高效，而且还应该具备生物相容性和生物可吸收性。临床上腹腔粘连不仅导致不孕、慢性盆腹腔痛及肠梗阻等并发症，还可以降低肿瘤细胞减灭术后的腹腔化疗效果甚至是化疗失败[10]。此次大鼠模型试验结果表明：装载卡铂的PECE水凝胶仍然具有良好的防粘效果及生物相容性和生物可吸收性；首先，溶胶态的卡铂-PECE水凝胶很容易从注射器中挤出并能够不受空间限制地粘附到腹膜创面上，在体温下很容易地形成柔软的膜样结构，该过程不需要添加交联剂或紫外线照射，这些特征使水凝胶不仅方便在开腹手术，而且还方便在腹腔镜手术中应用。其次，正是由于卡铂-PECE水凝胶的使用，不仅有助于延迟成纤维母细胞的入侵，同时在腹膜创面的间皮化过程中发挥重要作用。卡铂-PECE水凝胶预防腹腔粘连的关键在于间皮细胞层的修复重建。正常情况下，壁层腹膜的间皮化时间需要5～6 d，而脏层腹膜的间皮化时间需要5～8 d[11]。考虑可能和卡铂的局部应用延迟了腹膜间皮化过程有关，但是并不影响其预防腹腔粘连的效果。此外在手术后12天仍能够观察到炎性细胞层中的很多凋亡细胞。从而表明装载了卡铂的PECE水凝胶具有良好的药物缓释特性，可能意味着装载卡铂的PECE水凝胶能够提高卡铂的腹腔化疗效果。

在卡铂-PECE水凝胶治疗的大鼠中，不仅卡铂-PECE水凝胶应用部位没有发生粘连，而且没有应用卡铂-PECE水凝胶的腹壁切口也未出现粘连。相反，对照组的腹腔粘连不仅出现在相邻腹膜创面之间，而且还出现在腹壁切口和正常腹膜之间。卡铂是一种细胞毒性药物，可以对全身重要脏器有潜在毒性作用，但是，本实验结果表明将卡铂装载于PECE水凝胶中进行腹部应用并未增加对重要脏器的毒性作用。本实验证实载有卡铂并具有缓释特性的PECE水凝胶能有效地预防腹腔粘连的发生。这意味着对诸如晚期卵巢癌、输卵管癌以及其它腹膜癌症的手术创面涂抹载有卡铂的PECE水凝胶能够起到防粘效果，并为以后的腹腔化疗创造了有利条件。