王婧瑶，阎 中，王凯军

(清华大学 环境学院，北京 100084)

餐厨垃圾(Food Waste，FW) 具有高有机质含量(主要是蛋白质、油脂和有机酸)、高含水率及低热值的特性，相比于常规的固体废物处理方法(如焚烧和填埋)，好氧堆肥更适合处理餐厨垃圾，同时以肥料的方式从中回收可再生能源。源头收集的餐厨垃圾主要以淀粉、蛋白、脂肪等易降解物质为主，而纤维素类难降解物质含量较少。总糖、粗蛋白和粗脂肪含量高，对不同组分降解利用的微生物不同，对底物的分解消化具有阶段性，微生物群落结构出现更替现象，从而造成微生物差异性较大，表现出丰富的多样性及明显的优势微生物[1]。

餐厨堆肥过程是一个由细菌、放线菌、真菌等微生物共同作用并且在不同堆肥阶段由不同优势微生物群落互相演替的过程。一般堆肥物料中均含有大量的土著微生物群，随堆肥进程微生物迅速生长繁殖而发生结构演替。而通过人为添加特定的微生物菌剂则能加快堆肥进程，促进堆肥腐熟程度，提高堆肥品质，并具有控制恶臭气体的效果[2]。餐厨垃圾发酵中的微生物菌群可分解餐厨垃圾、抑制病原菌，是发酵反应器的核心，其种类和数量对反应器的运行至关重要。细菌由于体积小、比表面积大的特点，能快速有效地与有机物接触，而且，在堆肥体系中细菌的数量要远多于真菌，且耐温性普遍强于真菌[3]。通过添加菌剂减少了堆肥的生物多样性，迅速形成优势菌群，促进堆肥[4]。Takaku分析了添加稻壳的餐厨垃圾堆肥系统中微生物群落的结构与变化，发现主要的细菌为拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门及放线菌门，并且发酵各阶段具有不同的细菌群落[5]。Kulikowska等通过对比实验，培养不同微生物对有机垃圾进行分解，观察在堆肥过程中不同种类的菌剂对垃圾降解无害资源化的影响情况，对不同组分降解利用的微生物不同，对底物的分解消化具有阶段性，微生物群落结构出现更替现象，从而造成微生物差异性较大，表现出丰富的多样性及明显的优势微生物[6]。微生物菌剂的种类与含量是影响有机垃圾堆肥降解进程的重要因素。微生物菌剂复配方案如米曲霉、地衣芽孢杆菌、解脂假丝酵母、绿色木霉和褐球固氮菌联合强化了厨余垃圾中脂肪、蛋白质等特异组分的降解[7]。席北斗等将污泥和有机生活垃圾的混合堆肥中添加复合微生物菌剂，复合微生物菌群各菌种之间相互协同作用，生成抗氧化物质，形成复杂而稳定的生态系统，与灭活菌的对照组比较，堆肥腐熟时间可缩短6～18天[8]。菌剂的种类对堆肥结果的影响很大[9]。Akansha Bhatia[10]等培养不同微生物对有机垃圾好氧堆肥的影响，得出微生物对底物的分解消化具有阶段性，其群落结构出现更替现象，表现出丰富的多样性及明显的优势微生物。郑旴[11]等通过定性初筛和定量复筛，从202株细菌中筛选出对餐厨垃圾中淀粉、蛋白质、纤维素、油脂均有明显降解能力的活性菌4株，菌剂的种类对堆肥结果的影响很大。

推流式反应器(Plug-flow reactor，PFR) 是有机物厌氧消化领域中最常见的反应器，理想的PFR不将底物与所有污泥完全混合，而是与部分污泥混合后从反应器的进料端进入反应器，使其在反应器长度方向呈活塞方式依次向前推进，直至反应器的出料端出料[12-13]。针对传统工艺堆肥周期长，国内现有设备能耗高、占地大、不能连续运行等问题，本研究开发了基于PFR工艺的高温强化生物发酵系统。本研究是通过在反应器内设置不同发酵舱，并智能控制各区域的工况条件(温度、湿度、供氧等)，实现微生物在反应器内的分相。基于物料推流过程中的菌渣分离，确保新鲜进料与高效成熟菌体充分接触和反应，充分利用不同区域内的微生物种群，在提供高效发酵条件的同时，实现了连续进出料，处理效果不受进料频率影响，有机垃圾即产即清，提高了反应效率，极大降低了对周边环境的影响；同时由于有机垃圾在高温发酵阶段才真正实现高效分解，传统工艺在此之前需要较长启动期实现温度积累、微生物增殖等预过程，因此，本研究在底部设加热装置，解决辅料、菌种投加量大等问题，长期维持高活性腐殖化反应状态，成功实现迅速升温，使底物长期处于高温发酵状态，从而实现发酵周期的大幅缩短。

微生物群落组成和结构是餐厨垃圾有机物降解肥料化产生过程的基础，由于启动菌剂的施加或者各单元间的物料、环境和反应条件变化，微生物组成和多样性会出现较大波动，进而影响餐厨垃圾处理和资源化利用过程。目前对于餐厨垃圾处理主要过程中的微生物多样性分析仍然不足。利用宏基因组技术研究发酵体系中微生物变化，能够揭示微生物群落的细菌种类、数量及结构，对于发酵体系降解餐厨及抑菌等功能研究极其重要。本研究基于Miseq高通量测序技术，全面分析复合菌剂餐厨垃圾处理各工艺单元的微生物种群组成和多样性变化规律，优势微生物及潜在病原微生物等，为优化餐厨垃圾PFR好氧处理工艺提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 菌种及餐厨垃圾底物来源

本研究案例中，菌种来源为中源创能公司筛得的复合菌系。发酵底物取自德清县某农家乐的餐厨垃圾，经过预处理后含水率为75%。

1.2 样品来源及PFR工艺运行

反应器采用的是该公司自主研发的小型强化连续多仓式推流发酵(PFR)反应器，日处理能力4吨以下，反应器如图1所示，物料和菌种由1仓投加，物料缓慢流过2仓，最后到3仓腐熟，前两仓控温50℃～55℃，3仓为冷却仓，考虑可能带来微生物群落环境变化的工艺节点，本研究分别在1，2，3仓取样，标记为C01，C02和C03。考虑到实际生产中，出料后不能马上作为肥料运输及使用，会有一段时间静置期，因此将物料在空气中放置24 h，样品标记为Y02，菌种为Y01。无菌种发酵体系则是不接菌种，自然堆腐，3个仓的样品分别标记为NC01，NC02和NC03。

图1 PFR工艺示意图

1.3 微生物Illumina MiSeq 高通量测序

提取各样品的宏基因组DNA，扩增原核生物16SrDNA基因V3-V4区，采用Illumina进行高通量测序，进行原核微生物Alpha多样性指数分析、相似性聚类分析及群落多样性分析。

2 结果和分析

2.1 微生物多样性分析数据的可靠性

稀释曲线可以校验微生物多样性分析结果的数据可靠性。当曲线趋于平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的 OTU; 反之则表明继续测序还可能产生较多新的 OTU。复合菌系发酵体系5个样本共获得238092个有效序列，无菌种发酵体系4个样本共获得180741个有效序列。所有样本的稀释曲线接近平台(见图 2和图3)，测序深度已经基本覆盖样本中的所有物种，覆盖率高。说明此份数据有效可靠。

图2 复合菌种发酵体系的稀释曲线

图3 无菌种发酵体系的稀释曲线

2.2 微生物群落多样性指数分析

Alpha多样性是指一个特定区域或者生态系统内的多样性。本文通过 Shannon(香农指数)，Simpon(辛普森指数)，Chao1和ACE 这4个指标对餐厨好氧发酵反应器中的群落Alpha多样性进行分析。其中，chao1 用来估计物种总数，ACE可估计群落中 OTU 数目，Simpson和Shannon 用于估算为生物多样性，Simpson越大多样性越低，而Shannon越大多样性越高。

如表1所示，无菌系发酵3个仓(NC01，NC02，NC03)的Shannon由NC01的4.26减至4.22后又升到4.36，NC02的多样性下降，表明中间仓的物种略单一，整个发酵过程微生物多样性波动不大，可能是由于餐厨垃圾表面的细菌在适应新的环境，处于休眠状态，因此导致发酵体系多样性较稳定且无规律。而复合菌种发酵体系(C01，C02，C03)中，群落多样性随着PFR 3个仓的不断推流呈逐渐增加趋势，Shannon由C01的2.69 到2.81后升至 3.39，最后出料的Shannon为3.63，可以看出菌种的启动对于整个发酵体系的微生物群落多样性演替至关重要。

表1 微生物群落多样性指数分析

2.3 微生物群落聚类分析

非度量多维尺度法(NMDS)是一种将多维空间的研究对象(样本或变量)简化到低维空间进行定位、分析和归类，同时又保留对象间原始关系的数据分析方法。适用于无法获得研究对象间精确的相似性或相异性数据，仅能得到他们之间等级关系数据的情形。其基本特征是将对象间的相似性或相异性数据看成点间距离的单调函数，在保持原始数据次序关系的基础上，用新的相同次序的数据列替换原始数据进行度量型多维尺度分析。

由图 4 的NMDS分析可知，复合菌系启动下的样品C02，Y01和Y02 ，三者彼此距离互不接近，形成了一个三角形，表明三者在微生物组成上有很大的差别，三者分别代表了不同的发酵时期，即发酵菌种(Y01)、发酵中期(C02)及开袋期(Y02)。C03样品分别与C01，C02 及Y02样品距离较近，说明三者相比，发酵后期(C03)分别与发酵初中期(C01，C02)及开袋期(Y02)微生物群落构成相似性较大，也表明发酵初期、发酵中后期和开袋期三者之间的承继关系。同时C01和C02最为相似，说明整个体系中的微生物在发酵初中期经历了一个短暂的适应期。也有研究表明许多在中温段活动的微生物在高温段进入休眠期，然后在腐熟阶段又重新开始繁殖、新陈代谢并且进行堆肥活动[14]。

图4 复合菌种发酵体系PFR工艺中样品的聚类情况

而对于无菌种发酵体系的样品来说，由图 5的NMDS分析可知，3和5两个样品彼此距离互不接近，表明两者在微生物组成上有很大的差别，两者分别代表了不同的发酵时期，即发酵前期(3)及发酵中后期(4和5)。同时样品4和5最为相似，说明在发酵后期微生物菌系组成已经稳定。

图5 无菌种发酵体系PFR工艺中样品的聚类情况

2.4 微生物群落多样性门水平分析

从门水平上分析(见图6和图7)，复合菌种发酵体系的3个仓的3组样本通过Illumina Miseq 测序平台共获得243767条高质量有效序列，聚类分为275个操作分类单元，经分类学鉴定分属16个门，163个属。在门水平上，厚壁菌门 (Firmicutes) 始终占优势地位，其次是变形菌门，最后是蓝藻菌门。厚壁菌门主要以杆菌为代表，是咖啡或者稻米堆肥中高温相的主要群落组成，Dee’s 的研究表明，厚壁菌门，尤其是杆菌，是高温发酵阶段的主要微生物群落[15]。

图6 复合菌系发酵门水平下PFR推流工艺的发酵样品

图7 无菌系发酵门水平下PFR推流工艺的发酵样品

PFR推流工艺运行下的发酵样品，从C01到C02到C03最后再到Y02，厚壁菌门的比例由73%下降至69%再升至76%，最后稳定在75%。变形菌门从18%上升至20%后一直保持不变。尽管从门水平上看，随着发酵的进行，各优势菌门的比例均未有太大改变，但是在厚壁菌门中，一些种属如链球菌(streptococci)、乳酸菌(lactobacillus)和微小杆菌(exiguobacterium)比例却有所调整。

无菌种发酵体系有3大优势菌门，变形菌门(proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门 (Bacteroidetes)。有学者研究表明，拟杆菌门(Bacteroidetes)能有效地降解大分子物质如纤维素和木质素，可以将多种多糖降解为有机酸, 厚壁菌门(Firmicutes)与拟杆菌门(Bacteroidetes)呈现相反的趋势，因此这2个门的细菌在餐厨垃圾发酵体系中可能在降解多糖的过程中存在竞争关系[16]。

2.5 微生物群落多样性属水平分析

如图8所示，复合菌种发酵体系中的优势菌属为乳杆菌(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、微杆菌(Exiguobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、大洋芽胞杆菌属(Oceanobacillus)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、中华芽胞杆菌属(Sinibacillus)、慢生芽胞杆菌属(Lentibacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)和克雷白氏杆菌属(Kiebsiella)。

图8 经复合菌系发酵(Y01，C01，C02，C03，Y02)和无菌系发酵(NC01，NC02，NC03)的属水平的微生物群落分布图

而作为芽孢杆菌科的梭菌属，也出现在发酵体系中。梭菌属一直被认为是与复杂有机物降解相关的菌类[17]，在白酒窖泥中作为重要功能菌群[18]，它是一类严格厌氧的细菌，在降解碳水化合物的同时会产生乙酸、丁酸等产物，在生物液体燃料领域具有很好的应用前景，受到广泛关注[19]；另外，梭菌还可能与乙酸氧化及苯酚类化合物的降解有关[20-21]。这说明堆肥发酵的过程也不是严格意义上的好氧，某些没有搅拌翻堆到的位置形成了一个个狭小的厌氧空间。

随着发酵过程的进行，链球菌从38%降至发酵后的10%，由于链球菌是一种可以发酵简单的糖类，产酸不产气的致病菌，因此链球菌的减少意味着随着高温发酵的进行，有机废弃物的分解，餐厨垃圾终被无害化处理[22]。与此同时，乳酸菌属和微小杆菌属增多。微小杆菌属是一类革兰氏染色为阳性的碱性厌氧菌，其在分解有机污染物(偶氮染料、农药、石油等)，转化重金属，根际促生，工业污水处理等领域均具有一定的环境学意义[23]。

无菌系发酵的样品NC01，NC02，NC03中的优势菌属为乳杆菌(Lactobacillus)、依格纳季氏菌属(Ignatzschineria)、小杆菌属(Dialister)、拟杆菌属(Bacteroides)，其中乳杆菌(Lactobacillus)和依格纳季氏菌属(Ignatzschineria)隶属于变形菌门是其优势菌属，该种属经常存在于鸡肠道菌群中，也存在也脱氮系统中[24]。在活性污泥-生物膜复合系统脱氮除磷的研究中发现其适于附着在生物膜上生长，具有降解有机物和脱氮的优势[25]。在拟杆菌种属下面丰度最多的是普雷沃菌属(prevotella)和紫单胞菌科的Proteiniphilum。普雷沃菌属属常见无芽孢革兰阴性厌氧杆菌，是近年来从类杆菌属中分出的一个新菌属，主要集聚于正常人体的口腔、肠道等部位，它是临床上较常见的一种条件致病菌[26]。冯蕾在低温的条件下，用不同菌剂厌氧发酵羊粪产沼气，发现Proteiniphilum为其中优势菌群[27]。Proteiniphilum可以降解焦化废水中一些生物难降解的化合物(包括苯酚，甲基苯酚，二甲基苯酚，萘酚，三亚苯和吲哚)，在pH值为8的条件下有助于增强厌氧发酵的进程[28]。这说明，若无外源菌种的接入，在餐厨垃圾自然堆腐的过程中，很多来源于肠道和口腔的微生物大量增殖，造成了无菌种发酵体系多样性程度较高，然而并没有文献直接证明上述菌群的扩繁有利于好氧堆肥过程，因此解释了上述即使香农指数高于复合菌种发酵体系，但是出料效果并不好的情况。

Bacteroidetes能够产生纤维素酶、蛋白酶等水解酶，将纤维素、蛋白质和淀粉等大分子有机物降解产生 CO2、纤维二糖、葡萄糖和乙酸[29]。也有研究认为，Bacteroidetes是降解糖类的主要微生物菌群[30]。

2.6 微生物群落功能代谢通路分析

经过微生物群落功能代谢通路分析可知(见图9和图10)，复合菌系及无菌系发酵系统均是由碳水化合物运输代谢和氨基酸转运代谢占主导。这是由于两者有着相似的底物组成，包含米饭、馒头、肉类等高蛋白高碳水的物质。在微生物发酵底物过程中，碳在微生物新陈代谢过程中约有2/3变成二氧化碳而被消耗掉，1/3用于细胞质的合成，所以，碳被称为是细菌的能源，而氮主要用于细胞原生质的合成，用于细胞繁殖[31]。由于可能收集餐厨垃圾的批次位置不同，尽管二者携带了不同的菌系，却不影响其相同的底物组成下的主导代谢通路的相似性。

图9 KEGG注释PFR推流工艺节点下的复合菌系发酵样品

图10 KEGG注释PFR推流工艺节点下的无菌系发酵样品

3 结论与展望

本研究通过高通量测序分析获得复合菌系启动PFR好氧餐厨垃圾处理工艺过程的菌种对微生物种群、数量、结构、动态变化规律的影响等数据，为挖掘特定功能微生物，进一步优化餐厨垃圾处理工艺，促进PFR反应器系统的稳定和高效运行，提高餐厨垃圾发酵产物的资源化利用效率提供科学依据。

本研究的主要结论： 1)餐厨底物经复合菌种发酵后微生物多样性在不断增加(香农指数各个单元的变化规律为2.69—2.81—3.39)，而无菌系启动的发酵体系微生物多样性并无显著增加，且杂乱无规律; 2)主成分分析表明复合菌系启动下，前两个仓的样品聚类到了一起，说明发酵体系需要一个短暂的适应期; 3)在门水平上，复合菌种发酵体系中Firmicutes(厚壁菌门) 始终占优势地位，其次是变形菌门，而无菌种发酵体系中Proteobacteria(变形菌门)为优势菌门，Firmicutes(厚壁菌门)次之，在属水平上，复合菌种发酵体系的优势菌属为Lactobacillus(乳杆菌)和Exiguobacterium(微小杆菌)，而无菌种发酵体系的优势菌属为Ignatzschineria(依格纳季氏菌属)和Lactobacillus(乳杆菌); 4)虽然微生物群落组成不同，但经KEGG功能注释后发现两体系均由碳水化合物运输代谢和氨基酸转运代谢占主导，系宏观的相同餐厨底物3大类营养物质(碳水化合物、脂肪和蛋白质)所致。

基于研究结果，提出以下对策建议： 1)餐厨垃圾好氧PFR工艺优化：好氧PFR环境的群落组成结构可为反应过程性能提供参考，如厚壁菌门 (Firmicutes)和变形菌门(proteobacteria)两者的相互作用可提高好氧堆肥过程的稳定性，降低环境因素变化对发酵过程的冲击; 2)对于病原菌如链球菌属(streptococci)等在发酵过程中的逐步减少，我们可以筛选其拮抗菌对病原菌进行控制。