陈扬平 陈维玉 张秋霞 修建成

南方医科大学南方医院心血管内科（广州510515）

冠状动脉疾病（coronary artery disease，CAD）是全球最常见的死亡原因之一［1］。据世界卫生组织报告，2030年全球范围内冠心病死亡人数将占总死亡人数的13.1%［2］。已有研究［3］证实，稳定性心绞痛患者肠道内肠杆菌科和链球菌属的丰度显著高于健康人群。蔡军教授等［4］通过对稳定性心绞痛（stable angina，SA）患者和ST 段抬高型心肌梗塞患者血液微生物的宏基因组测序，首次报道肠道依赖性微生物易位引发心梗后炎症和心血管事件，通过抗生素治疗消除肠道细菌易位后，心肌梗死小鼠全身炎症和心肌细胞损伤得到缓解，这提示肠道菌群与冠心病存在一定的相关性。

根据临床症状、动脉阻塞程度和心肌损伤程度，冠心病分为稳定性冠状动脉疾病（stable coronary artery disease，SCAD）、不稳定性心绞痛（unstable angina，UA）、非ST 段抬高型心肌梗死（non ST elevation myocardial infarction，NSTEMI）和ST 段抬高型心肌梗死（ST elevation myocardial infarction，STEMI）［5］。流行病学和动物研究都表明菌群紊乱可能与动脉粥样硬化的进展相关，但鲜有研究报道不同临床分型冠心病患者肠道菌群的结构特征。因此，本研究拟对比分析不同临床分型冠心病患者和健康人群肠道菌群的结构差异，探究肠道菌群与冠心病严重程度的关系，为进一步探究冠心病的致病机制和冠心病的防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料本研究纳入了2017年6月至2018年3月在南方医科大学南方医院心血管内科住院的167 例冠心病患者。纳入标准为：（1）年龄20 ～80 岁；（2）性别不限；（3）根据欧洲心脏病学会稳定性冠状动脉疾病指南［6］和急性冠脉综合征指南［7-8］诊断的稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、非ST 段抬高型心梗及ST 段抬高型心梗患者。排除标准为：（1）样本采集前2 个月内使用过抗生素或益生菌；（2）有胃肠炎、胃肠道溃疡等胃肠道疾病；（3）合并肿瘤、肝硬化、慢性肾衰竭及影响肠道菌群的其他问题。选取同时段社区定期体检的43 位居民为健康对照组，纳入标准为：（1）年龄20 ～80 岁；（2）性别不限；（3）无心血管疾病病史（如高血压。冠心病、心衰等）；排除标准同上。本研究通过本院伦理委员会关于开展临床研究的审批，充分告知入组患者并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 样品采集和DNA 提取收集患者的新鲜粪便样本，20 min 内置于液氮罐中运送至实验室于-80 ℃保存。称取粪便样品20～50 mg，加PBS和0.5%Tween-20混匀进行-80 ℃10 min和60 ℃5 min反复冻融3 次，用蛋白酶K、RNA 裂解酶和10%SDS于55 ℃金属浴中裂解粪便样品，离心取上清液，加入酚、氯仿、NaoAC 和异丙醇抽提菌液DNA，并用75%乙醇洗涤沉淀，最后将DNA 样品溶解于双蒸水中。采用Qubit 对DNA 浓度进行定量，并通过Agilent2100 评价DNA 完整性，将DNA 质量合格的样本用于文库构建。

1.2.2 文库构建和16S rDNA 高通量测序采用二步PCR 方法构建样本文库，以不同样本DNA 为模板，通过PCR 反应完成第一轮扩增，采用磁珠法纯化PCR 产物，然后用含有不同index 的引物进行第二轮PCR 扩增，再经磁珠纯化后，应用Qubit 和Agilent2100检测文库质量。最后采用Illumina Hiseq测序平台对提取的DNA 样本进行16S rDNA V3V4区基因扩增及测序。

1.2.3 数据分析测序得到的原始数据经过质量控制测序接头序列、低质量序列和低复杂度序列，利用重叠关系进行序列拼接。应用Usearch10.0 软件在97%相似度下聚类得到操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）并去除嵌合体序列。基于Greengene 数据库对OTU 代表序列进行比对和物种注释。基于每个注释物种得到的reads 丰度，利用Kruskal-Wallis 方法计算5 组患者物种注释上的丰度差异情况。使用Qiime1.9.0 软件进行样品微生物α多样性分析，通过α多样性分析能够了解样品中微生物多样性程度，汇总不同样本中属于相同物种的reads 数据，计算样本间距离矩阵，得到的矩阵用于PCoA 可视化进行样品微生物β多样性分析。

1.3 统计学方法用R3.5.2 软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料使用均数±标准差表示，计数资料用率表示。使用基于Holm 矫正方法的Kruskal-Wallis 检验进行3 组以上正态分布资料的检验；计数资料比较用R×C 格表χ2检验或校正χ2检验或确切概率检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肠道菌群的组成和多样性分析本研究共入组稳定性心绞痛患者48 例、不稳定性心绞痛患者48 例、非ST 段抬高型心梗患者30 例、ST 段抬高型心梗患者41 例及健康对照43 例。其中稳定性心绞痛组男38 例，女10 例，年龄33 ～78 岁，平均（58.4 ± 10.4）岁；不稳定性心绞痛组男35 例，女13 例，年龄42 ～72 岁，平均（60.2 ± 5.3）岁；非ST段抬高型心梗组男23 例，女7 例，年龄42 ～76 岁，平均（57.6 ± 7.5）岁；ST 段抬高型心梗组男32 例，女9 例，年龄21 ～80 岁，平均（53.8±12.6）岁；健康对照组男30 例，女13 例，年龄34 ～80 岁，平均（62.7 ± 12.4）岁。5 组研究对象的性别、年龄差异均无统计学意义，具备可比性（χ2=5.767 6，P=0.217 2；F=2.402 1，P=0.055 89）。

本研究对粪便样品进行16S rDNA 高通量测序，获得了11 074 140 条高质量序列（平均每个样品52 734 条）。α多样性分析结果发现，5 组受试者肠道微生物的Observed_species、Chao1、Shannon、Simpson 指数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05，表1），即冠心病各组患者和健康人群在肠道菌群多样性差异无统计学意义，见表1。加权的主坐标分析结果表明5 组受试者之间的肠道菌群结构差异有统计学意义（P＜0.001，图1）。

表1 不同临床分型冠心病患者和健康人群α多样性指数比较Tab.1 Comparison of α diversity index between patients with different subtypes of CAD and healthy people ±s

表1 不同临床分型冠心病患者和健康人群α多样性指数比较Tab.1 Comparison of α diversity index between patients with different subtypes of CAD and healthy people ±s

指数Shannon Observed_species Chao1 Simpson稳定性心绞痛（n=48）4.29±0.65 204.91±27.82 245.60±32.35 0.85±0.07不稳定性心绞痛（n=48）4.17±0.94 202.15±25.57 242.06±27.42 0.81±0.14非ST 段抬高型心梗（n=30）4.50±0.70 208.94±18.59 247.60±20.68 0.87±0.07 ST 段抬高型心梗（n=41）4.24±0.71 202.44±22.85 242.88±26.57 0.84±0.10健康对照组（n=43）4.24±0.76 201.70±21.23 240.92±27.13 0.83±0.11 P 值1 0.98 1 0.76

图1 5 组受试者之间肠道微生物β多样性分析Fig.1 Analysis of beta diversity of gut microbiota between five groups of subjects

2.2 肠道菌群结构显著性差异分析

2.2.1 菌群门水平相对丰度比较肠道内菌群绝大多数归属于厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）4 类菌门。5 组受试者的厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门相对丰度比较结果显示：STEMI 患者变形菌门相对丰度显著高于对照组（P＜0.001，图2A）；4 组冠心病患者放线菌门相对丰度均显著高于对照组（均P＜0.05，图2B）；5 组受试者厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度组间差异均无统计学意义（P＞0.05，图2C、2D）。

图2 5 组受试者菌门丰度差异比较Fig.2 Comparison of the differences of gut microbiota among the five groups on the phylum level

2.2.2 菌群属水平相对丰度比较在属水平上，相对健康对照组，4 组冠心病患者链球菌属（Streptococcus）、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）、埃希氏菌属（Escherichia）、奇异菌属（Atopobium）和放线菌属（Actinomyces）相对丰度均显著升高（P＜0.05），萨特氏菌属（Sutterella）、粪厌氧棒状菌属（Anaerostipes）和罗氏菌属（Rothia）相对丰度均显著降低（P＜0.05）；NSTEMI 和STEMI 组颗粒链菌属（Granulicatella）相对丰度显著高于对照组（均P＜0.001）；STEMI 组克雷伯氏菌属（Klebsiella）相对丰度显著高于对照组（P＜0.001），冠心病另外3 组患者克雷伯氏菌属相对对照组虽有升高的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 5 组受试者之间的菌属差异Fig.3 Significant differences between the five groups of bacteria on the level of genus

3 讨论

本研究通过对冠心病各亚组与健康对照组肠道菌群的比较，发现5 组人群在菌群多样性上差异无统计学意义，但在菌群结构上存在明显不同，菌群相对丰度差异有统计学意义。5 组肠道菌群结构差异表现在门的水平上为，STEMI 组变形菌门相对丰度显著高于对照组（P＜0.001），4 组疾病组放线菌门相对丰度均显著高于对照组（P＜0.01）。有学者指出，肠道微生物群落的失衡通常源于变形菌门丰度的变化，微生态失调中的变形菌和宿主营养与代谢紊乱以及免疫失调的炎症密切相关［9］。PISANO 等［10］研究表明，冠状动脉斑块的细菌主要含有变形杆菌和放线菌的促炎表型微生物，动脉粥样硬化斑块中选择性地保留了促炎细菌，或许正是这“选择性地保留”导致了动脉斑块的不稳定性以及随后的心脏病发作。本研究也发现疾病组放线菌门和变形菌门相对丰度显著高于健康对照组，提示变形菌门和放线菌门可能作为冠心病潜在的诊断指标。

在属的水平上，链球菌属、埃希氏菌属、考拉杆菌属在4 组疾病组中的相对丰度均显著高于对照组（P＜0.05）。有研究［11］表明，急性缺血性卒中患者血栓中普遍存在绿藻链球菌细菌DNA，该链球菌可能导致脑血管疾病的发展和血栓形成。另有研究［12］报道肠道细菌DNA 可以在67.6%的冠状动脉斑块中扩增，最常见的是链球菌属（41.0%）。国内一项研究［13］也表明大肠杆菌属与血脂、肝功等临床代谢指标也有一定相关性。YANG 等［14］研究发现，芦红颗粒可以通过减少拟杆菌目和考拉杆菌属，从而改善肠屏障功能来逆转心梗后的心室重构。无论是与动脉粥样硬化、脑卒中相关的链球菌属，还是与临床指标相关的肠杆菌埃希氏菌属以及与急性心肌梗塞相关的考卡杆菌属均在冠心病组中显著增加，预示它们可能是促进动脉粥样硬化的有害微生物，提示重视这些致病菌可能有助于临床上对于冠心病患者的诊断治疗，但仍需更有力的实验依据支持。

此外，萨特氏菌属、粪厌氧棒状菌属和罗氏菌属在4 组疾病组中的相对丰度相对对照组均显著降低（P＜0.05）。有研究［15］指出萨特氏菌属与多种人类疾病相关，且与机体炎性反应呈负性相关。罗斯氏菌和粪厌氧棒状菌属为丁酸产生菌，丁酸盐可以通过上调对维持肠粘膜完整性至关重要的肠上皮紧密连接蛋白的表达，减少脂多糖、三甲胺等有害微生物代谢物质通过血肠屏障［16］，在富含植物多糖的饮食作用下，给ApoE-/-无菌小鼠移植产丁酸盐的肠道罗斯氏菌可调节小鼠结肠表观遗传，令小鼠肠细胞从利用糖酵解向脂肪酸转变，进而降低内毒素和炎症反应，延缓动脉粥样硬化的进展［17］。本研究结果显示冠心病患者肠道中与维持机体正常肠道屏障功能、碳水化合物代谢、降低内毒素和炎症反应有关的细菌丰度要低于健康人群，预示冠心病患者中有益菌减少可能会导致患者肠道正常生理功能受损，进而加速动脉粥样硬化的发展，这提示肠道微生态制剂或粪菌移植或许对冠心病患者的治疗有所帮助。

不仅如此，本研究还显示NSTEMI 组和STEMI组颗粒链菌属相对丰度显著高于对照组（P＜0.01），STEMI 组克雷伯氏菌属丰度显著高于对照组（P＜0.001）。DRANCOURT 等［18］指出，颗粒链菌属菌作为菌血症和感染性心内膜炎的重要病因，与感染性心内膜炎的发病率和死亡率有着紧密的联系。研究［19］表明，克雷伯氏菌与多种人类疾病包括高血压紧密联系，这与本研究中心的另一项研究［20］成果是互为补充的。本研究结果显示，疾病组中只有心梗组颗粒链菌属和克雷伯氏菌属相对丰度较对照组显著增高，提示这两种菌属或可监测冠脉斑块失稳乃至于血栓事件的发生。

本研究也有几点不足，首先，入组患者均来自南方医科大学南方医院心血管内科，具有明显的地域局限性。其次，影响肠道菌群组成的因素很多，如饮食、环境等，本研究无法考虑这些可能影响菌群的潜在因素，研究成果未来还需更大样本与多中心临床研究加以证实。另外，本研究结果还需构建相关动物模型予以进一步验证。