易路遥 杨婷婷 李 杰 刘绪平 吉伟佳 占翌领 章 红

(江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心, 南昌 330029)

香料是化妆品中使用次数最多，也是使用范围最广的一类添加剂，然而逐年增加的化妆品不良反应[1，2]报道显示，香料是引起皮肤病不良反应的常见致敏物质之一。据统计，化妆品过敏中至少有35%是由香料引起的[3]。新铃兰醛因具有持久的铃兰花香香韵和清淡而甜润的兔耳草花香气[4]，被广泛用于各种香型香精的调配，在各种百花香型的香水、香皂和化妆品中均有使用[5]。然而，该物质的过敏性已得到大量试验数据及化妆品过敏的不良反应案例支持[6，7]。2017年8月2日，欧盟委员会正式发布了(EU)2017/1410号法规[8]，在禁用物质清单附录II中增加了新铃兰醛( CAS 31906-04-4和CAS 51414-25-6两个同分异构体)。东盟化妆品委员会在2018年1月就正式发布指令禁止在化妆品中使用新铃兰醛。我国《化妆品安全技术规范》2015年版未将新铃兰醛列入禁用物质表，考虑到欧盟是我国进出口化妆品的重要市场，无论是从企业对外出口化妆品还是从未来化妆品的使用安全考虑，我国将新铃兰醛列入禁用组分表是必然的趋势，因此尽早建立新铃兰醛的检测方法十分必要。

目前我国新铃兰醛的企业标准不包含检测方法[9]，文献报道的气相色谱-质谱法(GC-MS)[10，11]和高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[12，13]测定致敏性芳香剂及香料类过敏原物质残留的基质分别为塑料玩具及化妆品，但文献报道的化妆品的前处理过于简单，缺乏净化步骤，可操作性不强。欧盟检测消费品中香料过敏原的标准方法[14]有仅适用于直接定容进样基质的GC-MS法、国外还有一些文献报道[15,16]HPLC法及分散液液微萃取GC-MS法测定化妆品中其他过敏香料。本研究改进了欧盟标准方法的样品前处理，使用新型固相填料，采用通过式SPE净化进行样品前处理，使检测方法适用性更广，再结合GC-MS /MS 联用技术进行定性定量分析，由于化妆品基质种类繁多，所含化学成分不下十几种，采用二级质谱在排除样品基质可能带来的干扰更有优势，定性更加准确，为化妆品中致敏香料的检测提供科学可行的方法依据。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

Agilent 7000C 三重串联四极杆气质联用仪(GC-MS/MS)(Agilentgs公司，美国)，弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm,1.0μm)HP-5MS、(30m×0.25mm,0.25μm)HP-5MS、(50m×0.32mm,0.5μm)HP-FFAP、(30m×0.32mm,0.25μm)DB-17MS、(60m×0.32mm,0.5μm) HP-INNOWA ( Agilent 公司，美国)；离心机(ThermoFisher公司，美国)；涡旋混合器(IKA公司，德国)。

新铃兰醛对照品 (货号C 14232000，批号：111528，新铃兰醛Ⅰ∶新铃兰醛Ⅱ=72∶28)购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；甲醇为色谱纯(Sigma)；无水Na2SO4为分析纯(国药集团)；Oasis PRiME HLB(200mg,6mL)、Oasis PRiME MCX(150mg,6mL)、Oasis HLB(60mg,3mL)(waiers公司，美国)。

美白晚霜、天然纯露保湿霜(儿童型)、淡斑乳、调理精华乳、净肤修护乳、祛痘爽肤水、茶树爽肤水、女士淡香水和少女香氛香水均为国产、男士香水为法国生产。

1．2 方法

1.2.1标准储备溶液的制备

称取新铃兰醛标准品0.1g( 精确至0.1mg，市面上仅有新铃兰醛同分异构体的混合对照品，按照归一化法 新铃兰醛Ⅰ∶新铃兰醛Ⅱ=72∶28换算各自的浓度) 至10mL棕色容量瓶中，甲醇定容，得到浓度为新铃兰醛Ⅰ7.2mg/mL和新铃兰醛Ⅱ2.8mg/mL的混合标准储备溶液，置于4℃避光保存。

1.2.2供试品溶液的制备

称取1.0 g(精确至0.001g)试样置于25 mL比色管(有10 mL刻度)中，加入甲醇约5 mL，于超声波清洗仪上超声15 min，再定容到10mL，混匀，以10000 r/ min高速离心15 min，取上清液加入2 g无水Na2SO4脱水，取2mL清液作为待净化液，置于通过式SPE小柱Oasis PRiME HLB(200mg,6mL)，直接收集流出液，经0.22μm有机滤膜过滤,滤液供测定用(凝胶、爽肤水类样品如基质杂质干扰较少，可不通过SPE小柱，取上清液直接过滤膜上机测定，香水类样品取样量为0.1 g)。

1.2.3色谱-质谱条件

HP-5MS 毛细管柱(30m×0.25mm,1.0μm)，载气为高纯氦气，流量为1.0mL/min ，程序升温：初始温度为60℃，保持2min 后以13℃/min 速率升至280℃，保持1min，进样口温度为280℃ ，进样模式为分流进样，分流比5∶1 ；EI 质谱测定条件: 70 eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，传输线温度280℃，碰撞气体(N2)流量为1.5mL/min，淬灭气体(He)流量为2.25 mL/min；溶剂延迟5min。数据采集方式: 多反应监测( MRM) ，目标物对照品总离子流图(TIC)及二级质谱棒状图见图1、图2、图3，目标物离子对信息见表1。

图1 新铃兰醛GC-MS/MS 总离子流色谱图

图2 新铃兰醛Ⅰ二级质谱图

图3 新铃兰醛Ⅱ二级质谱图

表1 新铃兰醛Ⅰ和新铃兰醛Ⅱ质谱信息

2 结果与讨论

2.1 色谱质谱条件的选择和优化

在色谱条件建立过程中，首先针对气相毛细管色谱柱进行了弱极性到极性的比较选择，分别用液膜厚0.25μm 的HP-5MS毛细管柱、液膜厚1.0μm 的HP-5MS毛细管柱、DB-17MS毛细管柱、HP-INNOWAX毛细管柱及HP-FFAP毛细管柱对标准品溶液进行分析，其中HP-5MS和DB-17MS出峰峰形较好，HP-5MS分离度较DB-17MS稍好，而HP-5MS液膜厚1.0μm比0.25μm的分离度更好，尤其表现在对大批量样品溶液进行分析时，故选择液膜厚1.0μm的HP-5MS毛细管柱，而DB-17MS毛细管柱可以作为备选在必要时起到排除杂质的作用，文献[14]就是选择了DB-17MS和VF-WAX两种极性的毛细管色谱柱，本实验未选择类似VF-WAX强极性的柱子，是考虑到实验对象没有文献[14]多，HP-5MS毛细管柱既能满足本实验对象较好的分离又是常规实验室必备的基础气相色谱柱，且较VF-WAX柱有极低的色谱柱流失特性，极高的耐高温特性及寿命长等。

程序升温比较了文献[14]的方法：初始温度为60℃，保持1min 后以3℃/min 速率升至230℃，然后10℃/min速率升至260℃考虑到欧盟的方法主要针对20几个实验对象的同时分离，且所使用的色谱柱最高温度限较低，所以设置了较缓的梯度，导致新铃兰醛直到40min左右才出峰，而实验中建立的程序升温在16min附近即可出峰，分离度还优于文献[14]，且本实验选择的色谱柱最高温度限达350℃，可以在梯度后端直接上升到280℃高温进行快速的杂质扫尾，故最终选择速率程序升温到280℃高温的条件。

质谱条件优化先确定了新铃兰醛Ⅰ和Ⅱ一级质谱SCAN模式下的基丰离子136和105为母离子，再采用反应产物离子模式下设置梯度递增碰撞电压(5ev～40ev，10ev间隔)分别进行轰击，分析各电压下的二级碎片离子强度，选择较特征的二级定量及定性离子，再在多反应监测模式(MRM)下优化各离子对的最佳碰撞电压。

2.2 提取溶剂的选择

化妆品的大部分方法均采用甲醇提取，前期简单比较了甲醇和乙腈，甲醇极性大，适用的基质会更广一些，且考虑到气相分析极少使用乙腈作为溶剂，乙腈毒性更大，就最终选择了甲醇，由于要上气相色谱，还增加了无水硫酸钠除水的步骤，甲醇作为溶剂对气相毛细管色谱柱会有一定溶解损伤，所以进样的时候设置分流比是有必要的。

2.3 固相萃取条件的优化

2.3.1SPE方案设计筛选

为了得到较干净的样品处理液，本研究考虑采用固相萃取这种目前通用的有机物净化手段来进行净化，而为了建立专属性好的SPE前处理方案，根据新铃兰醛化合物偏碱性的特征，试验设计比较PRiME HLB、PRiME MCX、HLB等不同填料的SPE柱，其中PRiME是新型适用于通过式处理方案的柱子，相对于传统的SPE柱有更简单、更快速、更洁净的优势，针对3款SPE柱，分别进行标准品过柱、样品基质过柱、样品基质过柱后添加标准品、样品基质添加标准品过柱4种设计分析，实验选用霜、乳、爽肤水3种代表性基质考察，标准品柱前柱后的添加量均使得最后上机的分析溶液浓度为4μg/mL。结果显示，标准品过柱实验中，PRiME HLB回收率110.6%、HLB回收率83.4%、PRiME MCX回收率48.6%；样品基质过柱实验中，未过柱的霜和乳样品溶液色谱图干扰峰远远多于过柱的，其中HLB去除干扰效果最佳，其次是PRiME HLB，PRiME MCX最多，爽肤水的3款柱子杂峰基本差不多；样品基质过柱后添加标准品和样品基质添加标准品过柱的实验中，通过提取后的样品中目标物峰面积与提取后加标的样品中目标物峰面积之比计算回收率，霜和乳的PRiME HLB回收率105.0%～120.0%、HLB回收率56.5%～26.7%、PRiME MCX回收率80.5%～96.1%，爽肤水的PRiME HLB回收率110.0%、HLB回收率78.0%、PRiME MCX回收率97.1%，进一步结合基质效应试验结果综合选择最佳SPE柱。

2.3.2基质效应实验

基质效应(ME)的计算等于2.3.1方案设计中各样品基质过柱后加标样品的目标物响应与对应浓度的标准品溶液的响应的百分比再减去100，如果结果为负数，则为基质抑制，如果结果为正，则为基质增强。本研究结果显示，霜和乳的基质效应PRiME MCX较强抑制(-68.1%～45.0%)，HLB和PRiME HLB为略微增强(18.0%～9.0%)，爽肤水的基质效应PRiME MCX一般抑制，HLB和PRiME HLB为略微增强。

综合比较，最后选择PRiME HLB(200mg 6ml)作为净化柱。推荐测定过程中使用待测样本相似的基质的阴性溶液配制标曲。

2.4 方法学验证

2.4.1基质匹配工作标准曲线

精密吸取标准储备溶液适量，用甲醇配制合适浓度的标准中间使用溶液，再用按照1.2.2方法制备的阴性基质溶液配制基质匹配工作标准曲线，浓度范围新铃兰醛Ⅰ为0.36mg/L ～ 7.2mg/L，新铃兰醛Ⅱ为0.14mg/L ～ 2.58mg/L，注入设定好色谱质谱条件的气相色谱-串联质谱仪测定，记录峰面积，绘制标准曲线，将标准工作溶液按浓度从低到高依次进行测定，以得到的定量离子色谱峰的峰面积(新铃兰醛Ⅰ：136.0/107.1，新铃兰醛Ⅱ：105.0/77.0)为纵坐标，对应的进样浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线，如表2所示(霜基质匹配工作曲线)，新铃兰醛Ⅰ和新铃兰醛Ⅱ在其线性范围内，浓度值与峰面积有良好的线性关系，线性相关系数均大于0.9900。

表2 新铃兰醛Ⅰ和新铃兰醛Ⅱ基质标准曲线

2.4.2精密度试验

精密量取标准曲线溶液中间浓度点(新铃兰醛Ⅰ2.88mg/L，新铃兰醛Ⅱ1.12mg/L)的溶液，注入气相色谱-串联质谱仪，重复进样6 次，测定，记录峰面积，计算新铃兰醛Ⅰ和Ⅱ均小于5%，仪器精密度满足实验要求。

2.4.3回收率及重复性试验

实验选取了霜、乳、爽肤水及香水4种较为典型的化妆品基质作为本底，分别设定了3 个添加浓度，霜、乳、爽肤水添加浓度为5mg/kg、10mg/kg、40mg/kg，香水添加浓度为50mg/kg、100mg/kg、400mg/kg，添加浓度以新铃兰醛Ⅰ计算，新铃兰醛Ⅱ按照比例计算，采用1.2项下的试验方法，对10mg/kg添加浓度平行6份试验，另外两个添加浓度平行3份试验。由结果可知，方法对于不同化妆品基底物质的回收率在80.0%～118.0%之间，相对标准偏差(RSD) 小于10%，其中重复6份回收试验新铃兰醛Ⅰ含量RSD为9.0%，新铃兰醛Ⅱ含量RSD为11.2%，方法重复性满足试验需求。

2.4.4定量限实验

以响应信号大于噪声10 倍时对应的标液浓度作为仪器定量限，在测定膏、霜、乳类、凝胶、爽肤水类样品时，新铃兰醛Ⅰ和Ⅱ方法定量限LOQ为0.1mg/kg，在测定香水样品时，新铃兰醛Ⅰ和Ⅱ方法定量限LOQ为1mg/kg。

2.5 实际样品的测定

采用建立的上述方法对10批样品开展了分析，其中霜2批，乳液3批，爽肤水2批，香水3批，结果显示，其中1批调理精华乳检出20.4mg/kg，1批男士香水(欧盟)检出110mg/kg，考虑乳类化妆品是混合香料中含有新铃兰醛香料，香水是一款欧盟禁用前生产的某知名品牌，应为直接使用新铃兰醛进行调香。

3 结论

本研究建立的是测定膏霜乳液类和液态水基类化妆品中新铃兰醛气质串联质谱测定的定量定性方法。对色谱质谱条件及固相萃取方案进行了优化，完成了基质效应及方法学验证等评价，本实验方法将通过式SPE净化处理方案与质谱检测结合，实现了化妆品中致敏香料的快速检测分析，该分析方法快速，准确，选择性好，为化妆品的质量安全检测提供了有效的技术手段。