欧阳勇，刘彦，叶洋波

（杭州市富阳区第一人民医院 血管外科，浙江 杭州 311400）

腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）是常见的慢性主动脉退行性疾病，具有高发病率和高病死率，严重危害中老年人生命健康。临床研究发现，主动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）异常增殖、巨噬细胞浸润和基质降解与AAA的发生发展密切相关[1]。但是，有关AAA发展过程中的炎症浸润和VSMCs增殖和凋亡的调控机制尚未完全阐明。近年研究发现微小RNA（miRNA）在AAA组织中异常表达，且与其发生发展密切相关[2-3]。已有研究表明，过表达miRlet-7a可下调炎症反应[4]，过表达miR-21可抑制VSMCs增殖和诱导细胞凋亡，促进AAA的发展[5]。此外，LIU等[6]研究发现，miR-19a在AAA组织中高表达，但其在AAA的发生发展进程中的作用机制尚不清楚。本研究通过检测miR-19a在AAA患者AAA组织和血清中的表达水平，探讨miR-19a对主动脉VSMCs生物学行为以及炎症浸润的影响和作用机制，以期为AAA临床治疗提供潜在靶点和实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 收集临床样本：组织标本为2015年3月至2017年6月于杭州市富阳区第一人民医院经手术切除的15例AAA患者的腹主动脉组织和器官移植中心行肝脏、肾脏器官移植术（供体排除AAA以及其他腹主动脉相关病变）15例患者残留的部分正常腹主动脉组织。血清样本来源于15例AAA患者和同期进行体检的15例健康者。手术前均告知患者并签署知情同意书，并获得本院伦理委员会批准。

1.1.2 细胞和主要试剂：人主动脉VSMCs（BNCC340185）和人单核巨噬细胞THP-1（BNCC100407）均购自广州北纳生物科技有限公司；细胞培养基RPMI-1640购自美国Thermo Fisher公司；细胞培养基DMEM/F12和α-MEM、胰蛋白酶和胎牛血清均购于美国Gibco公司；miR-19a inhibitor/mimic，pcDNA3.1-CDKN2B质粒以及阴性对照均由上海吉马公司合成；TRIzol试剂盒购自美国Invitrogen公司；LipofectamineTM3000和反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；Transwell小室购自美国康宁公司；ELISA试剂盒购于美国Sigma Aldrich公司；兔抗人细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B（cyclin dependent kinase inhibitor 2B，CDKN2B）、β-actin单克隆抗体和HRP山羊抗鼠IgG均购自美国Cell Signaling Technology公司；青霉素、链霉素、BCA蛋白定量试剂盒、CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；双荧光素酶报告基因试剂盒购自美国Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 巨噬细胞分离和培养：采用淋巴细胞分离培养基从AAA患者和健康体检者外周血中分离单个核细胞。采用PBS缓冲液按照1:1的比例稀释肝素化的血清，2000 r/min离心20 min，收集乳白上清液，再加入4 mL细胞洗涤液于2000 r/min离心20 min即可得到外周血单个核细胞。随后，将分离得到的外周血单核细胞悬液置于含有10%的胎牛血清、双抗（100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）、25 ng/mL单核细胞集落刺激因子的α-MEM培养基中培养。

1.2.2 细胞培养和转染：采用含有10%的胎牛血清和双抗的DMEM/F12培养VSMCs和采用RPMI-1640培养THP-1细胞，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。待细胞生长密度达到80%时，以2×105个/孔的浓度接种到6孔板中，置于培养箱中培养。铺板24 h内，培养至细胞单层密度达到50%～60%时进行转染。将VSMCs或THP-1细胞分别转染miR-19a inhibitor、miR-19a mimic和pcDNA3.1-CDKN2B。转染后放入培养箱培养8 h，更换双倍血清的培养基，继续培养48 h，收集细胞用于后续实验。

1.2.3 RT-qPCR检测miR-19a的表达水平：收集组织、血清样本和处理后的细胞，采用TRIzol提取细胞中总RNA，并采用NanoDrop检测RNA的浓度。随后，采用一步法反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，严格按照qPCR试剂盒说明书检测miR-19a表达水平，以U6为内参。miR-19a上游引物为5’-CTGGAGTGTGCAAATCTA TGC-3’，下游引物为5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6上游引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，下游引物为5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。实验重复3次。

1.2.4 Western blot检测蛋白的表达水平：收集处于对数期的VSMCs和THP-1细胞，采用RAPI裂解液提取细胞中的总蛋白，检测蛋白质浓度。进行10% SDS-PAGE分离蛋白、电转膜法将目的条带转移至PVDF膜上，以5%脱脂奶粉室温封闭1 h后分别加入CDKN2B（1:1000）和β-actin抗体（1:1000），4 ℃孵育过夜。之后，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG（1:2000）室温孵育2 h。最后，进行ECL染色，凝胶成像仪采集图像；通过ImageJ分析灰度值。实验重复3次。

1.2.5 CCK-8检测VSMCs细胞增殖活力：将经转染和未转染处理的VSMCs细胞培养至处于对数生长期后，以2×104个/孔的浓度接种于96孔板中，并在每孔中加入100 μL DMEM培养基（含有50%巨噬细胞培养上清），每组设6个复孔。置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养0、24、48、72和96 h后，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液（0.5 mg/mL）后继续于培养箱中孵育4 h后，采用酶标仪检测450 nm处的每孔光密度（OD450）值。

1.2.6 Transwell检测VSMCs细胞迁移能力：将经转染和未转染处理的VSMCs细胞培养至处于对数生长期后，以1×105个/孔的浓度接种于Transwell小室上室，下室加入500 μL混合培养基（250 μL巨噬细胞培养上清液和250 μL DMEM/F12培养基）后常规培养24 h。采用0.1%结晶紫染色20 min，并于光学显微镜下随机选择5个视野计算侵袭和迁移细胞数。实验重复3次。

1.2.7 流式细胞术检测VSMCs凋亡情况：取各组细胞以1×105个/孔接种于96孔板中，过夜培养后用胰蛋白酶消化细胞，PBS洗涤后加入300 μL结合液重悬，加入10 μL Annexin V-FITC室温避光孵育15 min，再加入5 μL PI溶液染色，混合均匀后避光孵育5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡百分比。

1.2.8 双荧光素酶报告基因验证miR-19a和CDKN2B的靶向关系：由湖南普拉特泽生物科技有限公司构建CDKN2B基因的3’UTR，插入pGL3-Promoter质粒载体中，将该重组质粒命名为pGL3-CDKN2B-3’UTR WT，采用基因突变法定点突变获得CDKN2B突变型载体（pGL3-CDKN2B-3’UTR MUT）。然后，将HEK 293T细胞接种于12孔板中，待细胞汇合度达到50%～70%时分别将miR-19a mimic和mimic-NC，CDKN2B野生型载体、CDKN2B突变型载体共转染于HEK 293T细胞中，转染6 h后更换为新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养液，继续培养36 h。最后，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活。实验重复3次。

1.2.9 ELISA检测炎性因子的表达水平：将经转染和未转染处理的THP-1细胞培养于含有50%巨噬细胞培养上清液RPMI-1640培养基中，培养结束后严格按照ELISA试剂盒说明书检测TL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS22.0对所有数据进行统计学分析。计量资料以±s表示，2组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-19a在AAA组织和血清中高表达 RT-qPCR检测结果显示，miR-19a在AAA组织中的表达水平明显高于正常腹主动脉组织（P＜0.01）。与健康组比，miR-19a在AAA患者血清中的表达水平明显上调（P＜0.01）。见图1。

图1 miR-19a在AAA患者组织（A）和血清（B）中的表达

2.2 敲降miR-19a可显著抑制VSMCs增殖、迁移和诱导细胞凋亡 RT-qPCR检测结果显示，相比于对照组，敲降miR-19a可明显下调miR-19a在VSMCs中的表达水平（P＜0.01），见图2A；CCK-8检测结果显示，敲降miR-19a后VSMCs增殖活力明显低于对照组（P＜0.01），见图2B；流式细胞术检测结果显示，相比于对照组，敲降miR-19a可显著诱导VSMCs凋亡水平（P＜0.01），见图2C；Transwell检测结果显示，敲降miR-19a可显著抑制VSMCs迁移能力（P＜0.01），见图2D。

2.3 敲降miR-19a抑制THP-1细胞炎症因子和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的表达 ELISA检测结果显示，相比于对照组，敲降miR-19a可明显抑制THP-1细胞中炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的表达水平（P＜0.01），见图3A-C。Western blot检测结果表明，敲降miR-19a可明显抑制单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、MMP-2和MMP-9的表达水平（P＜0.01），见图3D。由此可知，敲降miR-19a可明显抑制THP-1细胞中炎症因子和THP-1细胞表面蛋白的表达水平。

图2 敲降miR-19a对VSMCs增殖、凋亡和迁移（×100）的影响

2.4 miR-19a靶向负调CDKN2B的表达 通过比对TargetScan数据库发现，CDKN2B是miR-19a的潜在靶基因，其结合位点如图4A所示。同时，双荧光素酶报告基因结果表明，相比于对照组（mimic-NC），过表达miR-19a可显著减少野生型CDKN2B质粒的荧光素酶活性（P＜0.01），但对突变型CDKN2B质粒荧光素酶的活性没有影响，见图4B。Western blot检测结果发现，过表达miR-19a可显著下调VSMCs中CDKN2B蛋白的表达水平（P＜0.01），见图4C。

2.5 miR-19a靶向CDKN2B抑制VSMCs增殖、侵袭和诱导凋亡 Western blot检测结果表明，与对照组比，过表达CDKN2B可显著上调VSMCs中CDKN2B蛋白的表达水平（P＜0.01），但同时过表达miR-19a和CDKN2B后VSMCs中CDKN2B的表达水平与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），见图5A。CCK-8检测结果显示，过表达CDKN2B可显著抑制VSMCs增殖活力（P＜0.01），见图5B。流式细胞术检测结果表明，与对照组比，过表达CDKN2B可显著诱导VSMCs凋亡水平（P＜0.01），见图5C。Transwell检测结果显示，过表达CDKN2B后VSMCs迁移能力明显低于对照组（P＜0.01），见图5D。但同时过表达miR-19a和CDKN2B后可明显缓解仅过表达CDKN2B对VSMCs增殖、凋亡和迁移的调控作用（P＜0.01），见图5B-D。

图3 敲降miR-19a对THP-1细胞炎症因子和MMP表达的影响

2.6 miR-19a靶向CDKN2B下调THP-1细胞炎症因子和MMPs的表达水平 ELISA检测结果显示，相比于对照组，过表达CDKN2B可显著下调TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平（P＜0.01），但同时过表达miR-19a和CDKN2B可缓解仅过表达CDKN2B对炎症因子的抑制作用（P＜0.01），见图6。Western blot检测证实，相比于对照组，过表达CDKN2B可显著抑制MCP-1、MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平（P＜0.01）；但同时过表达CDKN2B和miR-19a后MCP-1、MMP-2及MMP-9蛋白的表达水平与对照组比差异无统计学意义。见图5A。

3 讨论

AAA是一种严重的迟发性血管疾病，病死率高。近年来，miRNA被广泛报道通过调控细胞生物学行为，进而参与多种疾病的发生发展进程。LI等[7]研究表明，miR-19a可作为心脏、血管和神经元相关疾病的早期诊断和治疗靶点。MENG等[8]研究发现，miR-183和miR-141与AAA的不良预后密切相关。过表达miR-155-3p通过促进VSMCs的增殖和抑制细胞凋亡，进而促进AAA的发生与发展[9]。PENG等[10]研究表明，过表达miR-26a通过靶向PTEN促进VSMCs增殖和诱导细胞凋亡，进而诱导AAA的发展。同时，前期研究也证实，异常表达的miR-19a与炎症和肿瘤密切相关[11-12]。本研究结果表明，与对照组相比，miR-19a在AAA主动脉壁组织和血清中高表达；敲降miR-19a可显著抑制VSMCs增殖和迁移能力，以及诱导细胞凋亡；同时，敲降miR-19a抑制了THP-1细胞因子和MMPs的表达。机制上，miR-19a通过靶向下调CDKN2B的表达，进而促进VSMCs增殖和转移，诱导炎症反应和MMPs的表达，从而加速AAA的发展进程。

图5 miR-19a靶向CDKN2B对VSMCs增殖、凋亡和细胞迁移（×100）的影响

图6 miR-19a靶向CDKN2B对THP-1细胞炎症因子表达水平的影响

巨噬细胞是炎症和免疫学的关键细胞之一，miR-19a在多种炎症递质作用下表达增强[13-14]。巨噬细胞的存在可损伤动脉壁，因为巨噬细胞产生的MMPs可以降解血管管壁中层弹力纤维，造成血管壁顺应性降低，并在血流的冲击作用下加剧瘤体扩张，使胶原蛋白产生崩解[15]。例如，敲降miR-33-5p可通过缓解THP-1炎症因子的表达和MMPs的表达，进而缓解AAA的发展进程[16]。同时，ZHANG等[17]研究结果证实，敲降miR-155通过抑制THP-1细胞炎症反应和MMPs的表达，进而缓解血管紧张素II诱导小鼠AAA形成。miR-195通过抑制炎性因子和MMPs的表达，缓解了AAA的发展进程[18]。与前期研究一致，本研究发现miR-19a水平在AAA患者组织和血清中高表达。同时，敲降miR-19a抑制了THP-1细胞上清液中炎症因子的表达水平以及主动脉弹性蛋白的表达。此外，过表达miR-19a促进了VSMCs的迁移。以上研究结果提示，抑制炎症反应和MMPs的表达可预防AAA动脉壁破裂的发生。

CDKN2B作为多种恶性肿瘤的抑癌基因，通过介导细胞增殖、周期和凋亡进而抑制肿瘤的发展进程[19-20]。在血管系统中，CDKN2B通过介导p53参与血管重塑[21]。LEEPER等[22]研究表明，敲降CDKN2B通过上调p53的表达，进而促进动脉瘤的形成。GAO等[23]研究发现，过表达miR-15a通过靶向抑制CDKN2B上调平滑肌细胞增殖和抑制细胞凋亡，从而促进AAA的发展进程。同时，本研究结果同样证实，敲降miR-19a通过靶向上调CDKN2B抑制平滑肌细胞增殖和诱导细胞凋亡，以及缓解THP-1细胞上清炎症因子和MMPs的表达，进而缓解AAA的发展进程。由以上实验结果和文献资料我们推断，miR-19a/CDKN2B分子轴在AAA的发生发展中发挥重要作用，并且调控VSMCs增殖、凋亡和细胞迁移以及炎性细胞浸润，但其能否作为新的治疗靶点投入到临床中还需要进一步深入研究。