潘璐璐，卢孔场，褚茂平，曾静静，荣星

（1.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 儿童心脏中心 温州医科大学心脏发育与转化医学研究所，浙江 温州 325027；2.温州市妇幼保健所 儿童健康管理科，浙江 温州 325000）

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一种常见急性发热出疹性疾病，表现为全身血管炎综合征，好发于5岁以下婴幼儿[1]。在发达国家中，这种疾病已成为儿童获得性心脏病的主要原因[2]。中国作为一个发展中国家，KD发病率也在逐年增长[3]。KD可累及全身各个器官，主要表现为心血管系统损伤，而冠脉损害是其主要危害，损伤机制可能归结于冠状动脉及其他中等肌性血管的内皮及弹性纤维的损伤，从而导致血管炎和血管壁的破坏，最终导致冠状动脉扩张甚至冠状动脉瘤的发生。鉴于KD目前临床无特异性的诊断指标，寻找其诊断、治疗、预后的新一代血清生物标志物显得尤为重要。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类转录本长度大于200 nt的非编码RNA，基因组序列中4%～9%的序列产生的转录本是lncRNA（相应的蛋白编码RNA的比例是1%）。由于lncRNA在多种体液如血液、尿液中均可检测出，使其成为了新一代生物标志物的热门候选。为此，本研究通过lncRNA芯片系统分析KD患儿血清中的lncRNA表达谱，筛选KD患儿特异相关的循环lncRNA RP11-86H7.1，并分析lncRNA RP11-86H7.1在KD诊断中的临床意义，为KD治疗寻找靶点提供基础。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选择温州医科大学附属第二医院育英儿童医院2018年4月至2018年12月确诊并收治的KD患儿25例，KD诊断依据美国心脏协会制定的诊断标准[2]。25例中男17例，女8例，年龄＜5岁，经超声检测，存在冠脉损害13例，无冠脉损害12例。选择同期门诊体检健康儿童24例、普通发热儿童17例及KD恢复期儿童22例，年龄＜5岁，排除肺、肝、肾、脑等重大疾病。各组研究对象的年龄、性别构成差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。本研究方案由温州医科大学附属第二医院育英儿童医院伦理委员会批准，所有研究对象监护人均签署知情同意书。

表1 4组研究对象一般临床资料的比较（±s）

表1 4组研究对象一般临床资料的比较（±s）

KD急性期儿童冠脉损害 无冠脉损害例数 24 17 22 13 12性别（男/女） 14/10 10/7 11/11 8/5 9/3月龄 25.00±15.74 49.27±32.78 27.00± 18.30 18.23± 14.72 21.00± 8.89白细胞（×109/L） 8.14± 2.13 10.86± 6.04 7.47± 2.51 15.57± 4.64 13.72± 3.39血小板（×109/L） 303.33±47.07 262.40±68.10 538.14±183.00 371.00±131.23 411.33± 87.01 C反应蛋白（mg/L） - 20.85±18.04 13.88± 9.65 84.92± 53.66 58.32± 35.94谷丙转氨酶（U/L） 15.67± 3.55 15.47± 7.95 28.36± 15.56 70.38± 92.80 32.42± 42.91谷草转氨酶（U/L） 35.00± 5.69 33.40±10.74 40.23± 10.91 42.85± 25.79 33.75± 16.67脑钠肽（pg/mL） - - 297.23±136.65 1013.31±875.08 502.58±324.12 D-二聚体（μg/mL） - - 1.38± 1.90 1.31± 0.74 2.11± 2.52临床特点 健康儿童 发热儿童 KD恢复期儿童

1.2 方法

1.2.1 样本采集：空腹采取静脉血2 mL，放置30 min后，1200×g离心10 min，吸取上清液至离心管中，4 ℃，12000×g离心10 min后分离上清至新离心管中，取250 μL血清加入750 μL TRIzol@LS试剂（美国Invitrogen公司）后所有血清样本均储存于-80 ℃，直至使用。

1.2.2 总RNA提取及cDNA第1链合成：从-80 ℃冰箱中取出血清样本冰上放置待解冻后加入200 μL氯仿剧烈震荡30 s，室温放置3 min，4 ℃ 12000 r/min离心15 min后，取上清液400 μL于新去RNase的EP管内，加入等量异丙醇-20 ℃过夜后，4 ℃ 12000 r/min离心20 min，弃上清后加入1 mL 75%乙醇洗涤，12000 r/min离心后加入10 μL DEPC水溶解RNA，利用Trans Script®One-Step g DNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）将RNA反转录为cDNA。

1.2.3 RT-qPCR检测血清lncRNA RP11-86H7.1表达：以cDNA为模版，在Bio-Rad CFX96 Touch PCR仪上，RT-qPCR对lncRNA RP11-86H7.1进行定量检测。lncRNA RP11-86H7.1上游引物：5’-CTCGGCTTCTCCTT ACCTT-3’，下游引物：5’-ACACCACCAATCTGAACCA-3’；以Has-GAPDH为内参，上下游引物分别为：5’-AACTCT GGTAAAGTGGATATTG-3’，5’-GGTGGAATCATATTGGAAC A-3’。按照试剂盒说明书，反应条件为预变性95 ℃3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，65 ℃ 5 s，扩增39个循环。所有样品均做3个平行孔，循环数取其均数。lncRNA RP11-86H7.1的相对表达量用2-△△Ct表示，△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因。

1.3 统计学处理方法 应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，2组比较采用配对t检验；利用ROC曲线分析和AUC评估血清lncRNA作为疾病诊断标志物的价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA RP11-86H7.1在KD患者血清中的表达

KD急性期与健康儿童、普通发热儿童及KD恢复期血清lncRNA相对表达量分别为6.33±7.37，1.57±1.59，1.61±1.13及1.37±0.56，KD急性期患儿血清lncRNA RP11-86H7.1表达水平明显高于健康儿童和普通发热儿童（P＜0.05），而KD恢复期即下降至接近健康儿童水平。见图1。

图1 KD急性期、健康儿童、普通发热儿童及KD恢复期血清lncRNA表达水平

2.2 血清lncRNA RP11-86H7.1水平对KD的诊断效能 绘制ROC曲线，评价lncRNA RP11-86H7.1在KD中的诊断价值。如图2所示，血清lncRNA RP11-86H7.1诊断KD的ROC曲线的AUC为0.783（95%CI=0.586～0.981，P＜0.05），当临界值（诊断阈值）取2.29时，其灵敏度为60.0%，特异度为91.7%，具有较高的诊断价值。

2.3 KD患者血清lncRNA RP11-86H7.1表达水平与KD临床特征关系 lncRNA RP11-86H7.1在血小板计数高于300×109/L的儿童血清中的表达明显高于血小板计数正常儿童的血清（P＜0.05），而在其他实验室指标上差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3 讨论

图2 lncRNA RP11-86H7.1对KD急性期诊断作用的ROC曲线

表2 lncRNA RP11-86H7.1与KD临床特征相关性分析

KD是一种在儿童时期能引起全身系统血管炎的严重发热疾病，且与成年期的冠状动脉病变存在极大的相关性，而发病机制目前尚不清楚。内皮损伤被证实是早期心血管疾病的危险标志物，可影响正常的稳态功能并有炎症活动特点[4-5]。目前已有报道，有KD病史的儿童在成年期出现冠状动脉粥样硬化导致了急性冠状动脉综合症或猝死[6]。因此及时诊断KD是预防冠状动脉并发症的最佳手段。

miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，目前在心血管病中已研究的较为透彻。如已有报道miRNA不仅可以作为KD诊断的标记物，而且可以成为KD冠脉损害治疗的靶点[7-8]。而lncRNAs是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，通过调节基因转录、蛋白翻译、mRNA剪切、miRNA吸附及作为蛋白骨架等多种方式发挥重要作用[9]。但lncRNAs在心血管疾病中的研究报道较少。有报道lncRNA Fendrr通过结合在组蛋白修饰复合体PRC2上，在胎鼠心脏及腹壁发育过程中起重要的调节作用[10]。WANG等[11]鉴定了一种心脏富含的lncRNAs，称为心脏肥大相关表观遗传调节器（chaer），它对心脏肥大的发展起调节作用，在心脏出现压力超负荷之前抑制chaer的表达可显著减轻心脏肥大和功能障碍。KO等[12]进一步了解了KD和冠状动脉瘤的发病机制，通过lncRNA分析表明XLOC_是最高表达的分子，冠状动脉瘤患者的XLOC_丰度显著增加，表明CD177 pos中性粒细胞的增加与KD有关，研究还提供了KD、抗IVIG的KD或冠状动脉瘤患者血液中的全长非编码RNA转录物，流行病学数据表明遗传因素是重要的KD易感性。KIM等[13]为了确定影响KD易感性的遗传变异，进行了一项全基因组关联研究和复制研究，3个位点的6个单核苷酸多态性与KD易感性显著相关。JIANG等[14]探讨lncRNAs在KD中的作用时，在KD模型中筛选出妊娠诱导的非编码RNA（PINC）在经TNF-α处理的HUVEC中显著过表达，发现PINC的敲除增强了用TNF-α处理的人内皮细胞的生存能力，增加了抗凋亡的表达，降低了凋亡基因的表达。提示PINC参与了TNF-α诱导血管内皮细胞凋亡的过程，可能成为KD治疗的新靶点。LI等[15]研究表明THRIL表达与KD儿童的一种急性炎症疾病患者症状的严重程度相关。lncRNAs和其结合蛋白可以调节TNF-α表达在人类先天免疫反应和炎症性疾病中扮演着重要角色。由此可见，lncRNAs在多种心血管疾病中发挥极为重要的作用，为心血管疾病治疗提供了新的靶点。

综上所述，尽管已可以证明lncRNAs的异常表达与心血管疾病的发生密切相关，但有关lncRNAs在KD的报道中只进行了一般性的论述，没有对候选的lncRNAs进行单独研究，在KD中的作用机制研究尚不深入。本研究结果提示，血清lncRNA RP11-86H7.1表达上调可作为诊断和评估KD预后的生物学指标。本研究通过RT-qPCR检测发现，lncRNA RP11-86H7.1在KD患者血清中的表达明显升高，将血清lncRNA RP11-86H7.1作为KD诊断指标，其灵敏度和特异度均大于60%。但本研究所纳入样本量有限，仍存在偶然误差的可能，其灵敏度和特异度以及临界值的选择还需在大样本量的人群中进一步验证。