钟女奇，朱兆玲，陈剑煌，周 红

（中山大学医学教学中心，广东 广州 510080）

双层溶血环[1]现象是多数产气荚膜梭菌[2-3]在血平板上的生长特性之一，是医学微生物学教学实验的重要、常规实验内客之一；其内环由θ毒素引起，较小、完全透明、在对光处可见到菌落周围有一层很亮的小环围绕着，外环由α毒素引起，大、不完全溶血。双层溶血环的效果、稳定性维持有多久，除了菌株、厌氧条件等外，培养基类型[3]也很关键。为了满足繁重的医学微生物学实验教学的需要，笔者们在前人的技术经验[4]基础上，在教学实验准备中，选用了一种市场上能方便购买到的苯乙醇琼脂厌氧培养基（EPA）[5]与前代自制的哥伦比亚兔血琼脂平板培养基（CRBA）[4、6]，进行了相关的比较实验；双层溶血环的效果更好、更稳定、维持时间更长，可长达1周以上，大大满足了教学要求，也符合科、教、研中的以“减少、替代和优化”为核心的“3R”[7]原则要求。以下是两种培养基的效果比较实验，希望抛砖引玉，为医学教学等实验应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与设备

细菌培养箱、厌氧罐等

1.2 培养基与试剂

哥伦比亚兔血琼脂平板[4]，苯乙醇厌氧培养基（购于广州市迪景微生物科技有限公司），鈀粒（苏州沃机械科技有限公司），美白指示剂[4]，柠檬酸A.R（洛阳市化学试剂厂批号150109），硼氢化钠（天津市北联精细化学品开发有限公司，批号：20140620）

1.3 方法

厌氧罐的密封性能检查（美白指示剂；复苏产气荚膜杆菌，接种于疱肉培养基37℃培养，第二天或6～8 h后观察浑浊状况，控制接种剂量1%[3]，进行1～3区划线；厌氧培养[4]；第2天观察结果；效果稳定性维持观察。

2 结 果

两种培养基均能获得清晰、亮丽的双层溶血环，但是同一菌株对兔血的溶血活性存在差异性、需要花更多的材料与时间去筛选，造成不必要的浪费问题；CRBA平板出现的溶血环有时两环分界不是很明晰，而EPA培养基更易分离出单菌落，两环分界很明显、环很有观感，没有滞泥感；在稳定性方面CRBA内双层溶血环在4℃基本可维持5～6天，但在室温只能1天左右，而EPA培养基出现的双层溶血环的内环，即使在18 h左右不如CBA明朗，但是第二天效果就胜于CRBA，并且EPA血平板效果稳定性可维持1个月（4℃），在室温1W左右。

3 讨 论

（1）本试验中所用两种血平板在营养成分上没有多大的差异，均富含对α毒素产生有益的营养素[2]，但是EPA中苯乙醇能与厌氧罐中产生的O2反应生成苯甲酸（降低了培养基的原pH 7.3+/-0.2），更彻底地消耗罐内的氧气，同时苯甲酸可利用罐内产生的H还原为苯乙醇，这种良性循环，使得厌氧环境更彻底、提供的pH环境更接近6.0，更有利于α毒素的产生[3]，这种良好循环使得EPA培养皿内环境中水分更少、更有力于观察菌落；EPA培养皿内厌氧环境维持时间也相对较长，已脱离厌氧罐环境，转移到普通室温环境中的菌株也能继续生长。（2）苯乙醇是很好的防腐、保鲜剂，有利于红细胞新鲜度的维持，这也使得EPA培养基中的双层溶血环会更大，不至于在短时间内双环融合、出现单环现象。（3）虽然空白EPA的鲜艳性不如CRBA、在价格上稍微贵一些，但是实际上是节约了成本，因为其不需要去浪费兔子与时间了。（4）所以在双层溶血环的实验结果示教中，EPA的应用效果更胜一筹。

4 效果图