霍 伟，黄贵庆，梁学政，郑厚平，潘文桉

(1.柳州市中医医院 药学部，广西 柳州 545000；2.广西医科大学第二附属医院 药学部，广西 南宁 530001)

益水生新饮颗粒是柳州市中医医院拟研究使用的中药制剂，该方由山茱萸、龟板、熟地黄、丹参、山药、杜仲等六味中药组合成方，六味中药合用滋补肾阴，平肝潜阳，祛瘀生新，舒筋活络，标本兼顾，调理阴阳，对于肾阴亏虚、虚热消渴、头晕耳鸣、腰膝酸软等症具有明显的疗效[1]。医院中药制剂是由中医医院或综合性医院为满足临床使用需求，严格按照国家相关政策法规，根据临床应用良好的经方、名方、验方研制而成，仅供本医院内部或限定单位调配使用的药品[2]。其来自于临床，服务于临床，经过临床上反复使用与实践，大多具备使用简便、疗效准确、价格便宜等特点，是中医临床用药的重要组成部分[3]。长期以来，柳州市中医医院为弥补市场药品不足、确保临床医疗需求，持续研制新的医院制剂，益水生新饮颗粒即为其中之一。

中药指纹图谱是目前被国内外业界研究领域普遍接受的一种质量评价方法，可以为研究者提供丰富多样化的鉴别信息，体现中草药繁杂化学体系的总体特性，对研究中药质量分析及控制具有十分重要的意义。在构建中药现代质量标准体系框架中，中药指纹图谱可作为关键核心技术之一[4-5]。因此，为了更好地控制制剂质量，获得稳定疗效，本研究采用HPLC研究并建立益水生新饮颗粒的指纹图谱，以期为其质量控制与评价提供科学依据。

1 实验材料

1.1 实验用对照品和中药材

对照品均采购自中国食品药品检定研究院(均可供含量测定用)：马钱苷(批号：200503)，熊果酸(批号：200517)，齐墩果酸(批号：200504)，毛蕊花糖苷(批号：201007)，梓醇(批号：201009)，丹参酮ⅡA(批号：201009)，丹酚酸B(批号：201009)，绿原酸(批号：200212)。

中药材均采购于南宁生源中药饮片有限责任公司，均符合2010年版《中国药典》饮片药材的要求：熟地黄(批号：120901，产地为山西)，山茱萸(批号：120901，产地为陕西)，杜仲(批号：120901，产地为四川)，醋龟甲(批号：120901，产地为湖北)，山药(批号：120901，产地为广西)，丹参(批号：120901，产地为甘肃)。

1.2 实验主要仪器及试剂

电子天平(型号：BP211D，德国赛多利斯)；高效液相色谱仪(型号：Agilent1260，分析软件为Agilent色谱工作站数据处理系统，美国Agilent公司)；双频数控超声波清洗器(型号：KQ-200VDB，昆山市超声仪器有限公司)，Millipore纯水仪(型号：simplicity 185，美国密理博公司)；水为纯净水；乙腈、甲醇、冰醋酸、磷酸均为色谱纯；乙醇为食用级乙醇，其他试剂如乙酸乙酯、正丁醇等为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品制备及处理

2.1.1 全方制剂 按《中国药典》2010年版一部附录ⅠC颗粒剂项下的要求：自制10批益水生新饮颗粒(S1-S10)，批号分别为：120214、130218、121124、130221、121101、121207、121204、121205、130220、130226，备用。

2.1.2 阴性制剂 根据要求制备益水生新饮颗粒方中各味药的阴性制剂，备用。

2.1.3 供试品溶液[6]取益水生新饮颗粒适量，研细，取细粉10 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，使用移液管精密加入50%乙醇溶液50 mL，称定重量，超声提取30 min，放置冷却，补足减轻的重量。过滤，取续滤液10 mL，用30 mL水饱和正丁醇振摇提取2次，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解，用甲醇定容至5 mL，作为供试品溶液。

2.1.4 对照品溶液 取马钱苷对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，制成每毫升含马钱苷0.112 mg的溶液，滤过，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱：Inertsil Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：乙腈-0.2%冰醋酸梯度洗脱(见表1)，流速：1.0 mL/min，检测波长：236 nm，柱温：25 ℃；检测器：DAD检测器。

表1 指纹图谱检测流动相梯度洗脱

2.3 指纹图谱参照峰

所建立的指纹图谱中，6号峰(后经对照品对比可知为马钱苷)分离度较好，出峰时间适中，峰面积较大且稳定，因此选其为参照峰。在后续内容中，均以该峰作为参照(标记为S)，用以计算其他峰的相对峰面积和相对保留时间。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取干燥至恒重的同一批(批号：121124)益水生新饮颗粒适量，研细，精密称取5 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，记录液相图谱。各特征峰相对保留时间RSD为0.13%，相对峰面积RSD均小于0.20%，说明该仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取干燥至恒重的同一批(批号：121124)益水生新饮颗粒适量，研细，精密称取5 g，共6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样，记录液相色谱图。各特征峰相对保留时间RSD为0.04%，相对峰面积RSD为0.13%，表明该方法具有较好的重复性。

2.4.3 稳定性试验 取干燥至恒重的同一批(批号：121124)益水生新饮颗粒适量，研细，精密称取5 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液。分别测定其在0 h，4 h，6 h，8 h，12 h，24 h的色谱，记录液相色谱图。各特征峰相对保留时间RSD为0.45%，相对峰面积RSD为0.87%，说明此样品在24 h内稳定。

2.5 指纹图谱的建立

于Agilent液相色谱工作站中将10批益水生新饮颗粒的色谱图以*.AIA格式文件导出，再将导出文件全部导入国家药典委员会2004年颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》进行共有峰数据匹配，确定14个共有峰。其中已确认已知成分为6号峰(马钱苷)及11号峰(丹酚酸B)，由于马钱苷为臣药山茱萸的有效成分，其分离度较好，出峰时间适中，峰面积较大且稳定，而丹酚酸B为方中佐药丹参的有效成分之一，相比较，其分离度不如马钱苷峰好，且为佐药成分，故选择马钱苷作为参照峰，标记为S。结果见图1、图2、图3。

图1 马钱苷的HPLC色谱

图2 益水生新饮颗粒HPLC相对色谱

图3 益水生新饮颗粒HPLC色谱匹配

2.5.1 指纹图谱共有峰标定结果 采用国家药典委员会2004颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》软件自动匹配10批次益水生新饮颗粒HPLC图谱，标定其中匹配数量为10批次的14个色谱峰为共有指纹峰，采用中位数法作为对照指纹图谱的生成方法，设定时间宽度为0.15 min，益水生新饮颗粒HPLC共有模式建立对照指纹图谱见图3。

由表2、表3可知，峰面积占总面积5%以上的共有峰为1、3、6、10、11、14号。以马钱苷峰(6号峰)的保留时间和峰面积作为1，分别计算共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示，益水生新饮颗粒的相对保时间RDS小于2.0%，相对峰面积RSD小于9.0%。

由此可知，本实验建立的色谱方法可以使益水生新饮颗粒具有基本一致的色谱行为。

表2 共有峰中单峰面积百分比≥5%相对峰面积

表3 10批益水生新饮颗粒共有峰相对保留时间

表4 10批益水生新饮颗粒共有峰相对峰面积

2.5.2 共有峰与非共有峰面积的计算结果 依据目前中药注射剂指纹图谱研究技术要求的有关规定，供试品的图谱与指纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积的10%，由表4、表5可知，益水生新饮颗粒的非共有峰总面积百分比皆少于10%。

2.5.3 相似度分析 使用国家药典委员会颁布的2004版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》软件进行指纹图谱相似度计算，以中位数为相关系数，设定时间宽度为0.15 min，通过系统自动匹配，得到了10批益水生新饮颗粒HPLC指纹图谱间的相似度，结果表明10批益水生新饮颗粒指纹图谱与对照指纹图谱的相似度值均大于0.9，与对照指纹图谱有良好的相似性。结果见表6。

表5 共有峰与非共有峰面积的百分比

表6 益水生新饮颗粒HPLC指纹图谱相似度计算结果

3 讨论

3.1 供试品溶液的制备研究

本实验初期，经查阅文献复方制剂供试品的制备[7-10]，应优选合适的溶剂进行提取，并采用合适的提取方法，最大限度将有效成分及其他活性成分提取出来，这样制备的供试品，在指纹图谱中更容易获得较多的特征峰。本研究采用单因素考察法比较了40%甲醇、70%甲醇、50%乙醇直接提取及50%乙醇提取之后用水饱和正丁醇萃取的情况，结果表明，经水饱和正丁醇萃取之后供试品所得的液相色谱图分离度较好。

3.2 流动相的优化选择

本研究通过对多种流动相进行对比、等度洗脱与梯度洗脱法进行比较、梯度洗脱条件的改进，寻找适合益水生新饮颗粒指纹图谱分析的色谱条件[11-12]。实验结果表明，甲醇-水或酸系统基线不稳定，信息较少，而乙腈-水或0.1%酸系统分离度不好，乙腈-0.2%冰醋酸所得图谱分离度较好，所提供的信息量稍多。因此，最终采用的流动相为乙腈-0.2%冰醋酸。中药复方制剂成分比较复杂，等度洗脱程序分离效果差，梯度洗脱能够使成分得到很好的分离[13-14]。

3.3 峰归属

实验中分别做了缺山茱萸、缺熟地黄、缺丹参及缺山药的阴性实验，从所得图谱中大致做了峰归属。其中缺山茱萸的色谱图与样品的色谱图比较得出：缺山茱萸的色谱图中会缺少1、2、6、14号峰及5号与6号峰之间的峰，缺熟地黄的色谱图会缺少1、2、14号峰，缺丹参的色谱图会缺少5、8、9、11、12、14号峰，缺山药的色谱图会缺少7、13、14号峰；由此可见，样品色谱图中属于山茱萸的特征峰只有6号峰，属于山药的特征峰有7、13号峰，属于丹参的特征峰有5、8、9、11、12号峰。

4 结语

本文对益水生新饮颗粒指纹图谱分析做了初步研究，仅选用了自制的十批颗粒样品，益水生新饮颗粒的广泛性与统一性尚显不足，应收集更多不同批次的颗粒样品，获取更多信息，确保指纹图谱具有更好的特征性和代表性。关于峰归属的实验，本文只是做了粗略研究，还需要加以完善。