响应面法优化油茶枯饼中油茶皂苷提取工艺

2020-07-23吴样明孙函静张品南谢有发季巧遇

亚太传统医药 2020年6期

吴样明，邵坚，孙函静，甘侠，张品南，谢有发，季巧遇，2*

(1.江中药业股份有限公司，江西南昌 330004；2.江西中医药大学，江西南昌 330004)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)，属山茶科(Theaceae)山茶属(CamelliaL.)植物，为常绿小乔木或灌木，是我国一种重要的油料植物[1]。油茶枯饼又称茶饼、茶粕、饼粕等，是油茶籽经过压榨出油后剩余的残渣，其量约为茶油产量的3倍。油茶籽仁含油率约40%～45%，目前多采用95#螺旋榨油机，出油效率约93%～95%[2]。油茶皂苷是从油茶枯饼中提取出来的五环三萜类混合物[3]，是一种性能优良的非离子型天然表面活性剂，并具有溶血性、镇痛、抗菌、免疫抑制等多种生物活性[4-9]。但目前对油茶皂苷的提取效率普遍不高，目前，我国油茶种植面积约有300万hm2，油茶籽年产量约为100万吨，年产茶油约26万吨。油茶栽培历史悠久，油茶产业作为江西省林业的主导产业，全省油茶总面积75万hm2，目前全省油茶种植面积和茶油产量均居全国第二位。油茶枯饼里面含有较多的油茶皂苷、茶多糖和蛋白质等成分，由于油茶枯饼中含有皂苷，味苦且有毒性，目前绝大部分茶饼被用作清塘剂、肥料和燃料，甚至废弃，造成了极大的资源浪费。本研究主要通过对油茶枯饼中油茶皂苷提取工艺的优化进行研究，以提高油茶产业农副产品的资源利用率，具有非常重要的经济意义和良好的应用前景。

1 仪器与材料

1.1 实验材料

油茶枯饼药材来源于江西省赣州市上犹县安和乡。主要试剂：油茶皂苷对照品(实验室自制，经鉴定其纯度为98%)；香兰素(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；硫酸(江西同盟试剂化工厂，分析纯)；无水乙醇(天津恒兴化学试剂制造有限公司，分析纯)；氢氧化钠(粒状)(天津恒兴化学试剂制造有限公司，分析纯)；盐酸(西陇化工股份有限公司，分析纯)。

1.2 实验仪器

UV-1750型紫外分光光度计(岛津国际贸易有限公司)；HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；电子万用炉(天津市泰斯特仪器有限公司)；KQ-500B型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；METTLER AE240电子天平(梅特勒托利多仪器有限公司)；BUCHI旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。

2 实验方法

2.1 油茶皂苷含量测定方法

采用紫外-可见分光光度法测定提取液中油茶皂苷的提取率。

2.1.1 最大吸收波长选定用紫外-可见分光光度计在450～700 nm处对油茶皂苷对照品进行扫描，选取最大吸收波长作为油茶皂苷的检测波长。精确称取油茶皂苷对照品0.5 g，加入蒸馏水定容至50 mL，量取0.5 mL后加水定容至25 mL，取0.5 mL加入香草醛-浓硫酸显色剂(0.5 mL的8%香草醛-无水乙醇加入4 mL 77%浓硫酸)于60 ℃加热15 min后，在冷水中冷却3 min，以显色剂为参比溶剂，用1 cm比色皿在可见光区扫描，在550 nm处有最大吸收，与相关文献报道相符合(550±2 nm)，见图1。

图1 油茶皂苷紫外图谱

2.1.2 显色剂稳定性考察精确量取0.000 2 g/mL的油茶皂苷对照品溶液0.5 mL，加入香草醛-浓硫酸显色剂进行显色反应，冷水中冷却后，每隔5 min测其吸光度A，A1=0.191 7，A2=0.191 7，A3=0.191 6，A4=0.191 5，A5=0.191 1，A6=0.190 4，其RSD%<5%，显色剂表现出很好的稳定性。

2.1.3 标准溶液制备精确称取油茶皂苷对照品0.5 g，加水定溶至50 mL，分别取0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL，加水定容至25 mL，再分别取0.5 mL测其吸光度，以吸光度(A)与标准溶液的质量百分比浓度C(g∕mL)，求回归方程。浓度在0.000 2 g/mL～0.001 g/mL范围内呈线性相关，见图2。

图2 油茶皂苷标准曲线

油茶皂苷的提取率的计算公式：

油茶皂苷提取率(%)=油茶皂苷的质量浓度C(g/mL)×定容体积(mL)×稀释倍数/样品质量(g)×100%

2.2 油茶皂苷提取工艺的单因素考察

本实验采用水为溶剂来提取油茶皂苷，考察不同因素对油茶皂苷提取效果的影响。水提法对油茶皂苷的提取效果的影响因素包括：提取溶剂的pH值，提取温度，提取时间和液料比。

2.2.1 提取温度的考察分别精确称取枯饼20.0 g，加入80 mL水，配制成溶液(pH=9.0)，分别在60 ℃﹑70 ℃、80 ℃﹑90 ℃﹑100 ℃下提取3次，每次提取30 min，提取液调整为pH=7.0后蒸干，称取2.0 g浸膏加水定容至25 mL，再精确量取0.25 mL定容到10 mL，测其吸光度A。见图3。

图3 提取温度对油茶皂苷提取率的影响

2.2.2 溶剂pH考察分别精确称取油茶枯饼20.0 g，加入80 mL水，配成pH=5.0﹑6.0﹑7.0﹑8.0﹑9.0、10.0的溶液，于60 ℃水浴下提取3次，每次提取60 min，提取液调整至pH=7.0后蒸干，称取2.0 g浸膏加水定容至25 mL，再精确量取0.25 mL定容至10 mL，测其吸光度A。结果见图4。

2.2.3 提取时间的考察分别精确称取20.0 g枯饼，加入80 mL水，在pH=9.0，温度为80 ℃的条件下分别提取40 min﹑60 min﹑80 min﹑100 min和120 min，每个时间段提取3次，提取液调整为pH=7.0后蒸干，称取2.0 g浸膏加水定容至25 mL，再精确量取0.25 mL定容到10 mL，测其吸光度A。见图5。

图4 pH对油茶皂苷提取率的影响

图5 提取时间对油茶皂苷的提取率的影响

2.2.4 液料比的考察分别精确称取20.0 g枯饼，按照1∶4﹑1∶5﹑1∶6﹑1∶7﹑1∶8加入水，在pH=9.0，温度为80 ℃的条件下提取3次，每次提取80 min，提取液调整为pH=7.0后蒸干，称取2.0 g浸膏加水定容至25 mL，再精确量取0.25 mL定容到10 mL，测其吸光度A。见图6。

图6 液料比对油茶皂苷提取率的影响

2.3 响应面法优化提取工艺

2.3.1 响应面分析因素水平的选取在综合单因素考察实验结果的基础上，以溶液pH、提取温度、提取时间和液料比为自变量，根据Box-Behnken Design响应面设计原理，采用4因素3水平的响应面分析方法进行实验设计，设计水平与代码，见表1。

表1 响应面实验因素水平

2.3.2 响应面分析法试验设计及结果精确称取油茶枯饼20.0 g，按表2所列试验条件进行提取，其中3、4、6、14、20为中心实验，用来估计实验误差，其他是析因实验。采用Design-Expert.V8.0.6软件处理得响应面分析结果，见表3和图7-图10。

表2 响应面分析方案及实验结果

2.4 响应面回归模型的优化

经过Design-Expert.V8.0.6软件的分析和计算得出的编码自变量X1、X2、X3、X4的二次多项回归方程为：

对回归方程进行检验，相关系数R2=81.86%，P<0.01，说明响应值(提取率)的变化有81.86%来源于所选变量，即提取温度、溶剂pH、提取时间和液料比。证明此回归模型显著，拟合程度好，回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用此回归方程确定最佳提取工艺条件。对回归方程系数进行显著性检验(表6)，表明提取温度X1、溶剂pHX2、液料比X4及其二项式X12对油茶枯饼中油茶皂苷提取率有显著影响；其他变量的影响均不显著(P>0.05)。依据系数估计值X1=-1.24、X2=-0.87、X3=0.37、X4=1.35可知因素的主效应关系为液料比>提取时间>溶剂pH>提取温度。