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(1.江西农业大学食品科学与工程学院,江西省发展与改革委员会农产品加工与安全控制工程实验室,江西南昌 330045;2.江西共青江中食疗科技有限公司,江西九江 332020;3.萍乡学院,江西萍乡 337000)

‘修水化红’是江西省一种特色甜橙类水果,主要种植在赣西北的九江修水地区,具有500多年的种植历史,其味道鲜美,甜而略酸,深受广大消费者的喜爱。研究表明‘修水化红’果实具有健胃消食、止咳化痰、宽中消油腻等生物活性,皮可入药,是一种特色的保健柑橘类水果[1]。当前‘修水化红’果实除了鲜食,还经常用于加工果干片、果酱、果糕等产品,其中果干片是‘修水化红’最普遍的加工产品,经常以冲泡的形式食用。同时民间也多采用‘修水化红’果皮加工成茶类产品冲泡或药用。研究表明黄酮类化合物是柑橘果实中主要的功能活性成分之一,具有抗氧化、抗炎症、抗癌、抗病毒等多种生物活性[2]。本团队在前期研究发现,‘修水化红’果皮总黄酮含量为9～10 mg芦丁(RT)/gDW左右,橙皮苷含量为30～35 mg/gDW左右,且果皮橙皮苷含量高于同时期采收的南丰蜜桔早熟系果皮、新余蜜橘果皮、三湖红橘果皮等的橙皮苷含量,黄酮类物质含量丰富[3-4]。因此,阐明不同冲泡条件对‘修水化红’皮茶的主要生物活性物质-总黄酮的影响有着重要的意义。

食品组分的浸出是一个复杂的过程,与物料、溶剂及浸出条件密切相关[5]。研究表明,冲泡料水比、水质、冲泡温度、冲泡时间及冲泡次数等因素均能影响多酚、黄酮等植物生物活性物质的浸出[6-7],且呈现一个综合的调控作用。李志英等[8]试验结果表明冲泡容器、水质、温度及时间均会影响陈皮中橙皮苷的浸出,采用紫砂壶、矿泉水且在高温长时间冲泡下利于提高橙皮苷的浸出率。

此外,挥发性风味是评价茶叶与花茶饮品的主要品质指标,对茶叶品质贡献率达25%～40%左右,人们喜爱饮用各类茶汤的一个主要原因是冲泡后所挥发的香气[9]。茶的香气是茶中各种挥发性风味成分综合作用的效果与体现,对茶与茶汤的挥发性风味成分进行测定与分析可以比较直观的体现其香气[10]。顶空固相微萃取-气相色谱-质谱连用(HS-SMPE-GC-MS)技术能够对挥发性风味成分进行提取、定性与定量分析,是当前用于提取和鉴定食品或农产品中的挥发性风味的主要技术。HS-SMPE-GC-MS技术无需有机溶剂、操作简单、重现性与准确度高,国内外研究人员采用此技术研究了李、葡萄、菠萝、杨桃、榴莲等水果的挥发性成分的含量和种类[11]。

当前,关于‘修水化红’皮中的主要的生物活性成分-总黄酮在冲泡过程中的变化规律鲜有研究,‘修水化红’皮茶挥发性风味成分也未见相关报道。因此,本论文主要研究冲泡料水比、水质、冲泡温度、冲泡时间、冲泡次数对‘修水化红’皮茶总黄酮含量的影响,重点建立冲泡温度-时间、冲泡温度-次数与总黄酮含量之间的关系与回归方程,并采用HS-SPME-GC-MS技术对‘修水化红’皮茶的挥发性风味成分进行测定与分析,旨在为科学冲泡‘修水化红’皮及其茶饮料的加工提供一定的理论依据,促进‘修水化红’皮的资源开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

‘修水化红’甜橙果实 2016年10月10日采摘于江西省修水县西港镇基地,选择树龄、树势与结果基本相同的果树并从树冠中部外围采集形状大小均一的果实,采摘后当天运回实验室置于7～10 ℃的冷库中保存;超纯水、蒸馏水 实验室自制;纯净水(桶装) 南昌市三康食品厂;矿泉水 润田矿泉水;天然水 农夫山泉天然饮用水;芦丁(RT,纯度≥98%) 北京索莱宝科技有限公司;硝酸铝、亚硝酸钠 国药集团化学试剂有限公司。

Sp-754PC型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;DVB/CAR/PDMS(Gray/plain Hub)固相微萃取纤维头 美国Supelco公司;6890N-5975气相色谱质谱联用仪 安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的预处理 取用‘修水化红’果皮,60 ℃热风干燥,磨粉并过60目(0.25 mm)筛备用。

1.2.2 料水比对‘修水化红’皮茶总黄酮含量的影响 称取0.5 g左右的‘修水化红’皮置于150 mL锥形瓶中,分别按1∶50、1∶75、1∶100、1∶125、1∶150、1∶175 (g/mL)的比例加入70 ℃的蒸馏水,后置于70 ℃水浴条件下静置10 min,取出立即抽滤,收集滤液测定总黄酮含量。

1.2.3 水质对‘修水化红’皮茶总黄酮含量的影响 称取0.5 g左右的‘修水化红’皮置于150 mL锥形瓶中,按1∶125 (g/mL)的比例分别加入70 ℃的超纯水、蒸馏水、纯净水、自来水、矿泉水与天然水,后置于70 ℃水浴条件下静置10 min,取出立即抽滤,收集滤液测定总黄酮含量。

1.2.4 冲泡温度-时间对‘修水化红’皮茶总黄酮含量的影响 称取0.5 g左右的‘修水化红’皮置于150 mL锥形瓶中,按1∶125 (g/mL)的比例分别加入60、70、80、90及100 ℃的蒸馏水,后分别置于60、70、80、90及100 ℃水浴条件下各静置2、4、6、8、10、12及14 min,取出立即抽滤,收集滤液测定总黄酮含量。

1.2.5 冲泡温度-次数对‘修水化红’皮茶总黄酮含量的影响 称取0.5 g左右的‘修水化红’皮置于150 mL锥形瓶中,按1∶125 (g/mL)的比例分别加入60、70、80、90及100 ℃的蒸馏水,后分别置于60、70、80、90及100 ℃水浴条件下各静置14 min,取出立即抽滤,收集滤液(第1次冲泡的茶)测定总黄酮含量,分出滤渣并置于60 ℃烘箱下干燥至恒重,后取置于150 mL锥形瓶,按1∶125 (g/mL)的比例分别加入不同的温度蒸馏水,后分别置于不同温度的水浴条件下各静置14 min,取出立即抽滤,收集滤液(第2次冲泡的茶)测定总黄酮含量,分出滤渣并置于60 ℃烘箱下干燥至恒重,之后再重复上述冲泡、抽滤等步骤至第6次冲泡结束。

1.2.6 总黄酮的测定 总黄酮的测定方法参照周明等[3]进行。具体如下:吸取10 mL‘修水化红’茶置于25 mL具塞试管中,加入1 mL 5%的亚硝酸钠溶液,室温避光静置反应6 min,后加入1 mL 10%的硝酸铝溶液,再静置反应6 min,最后加入4 mL 4%氢氧化钠溶液并用60%的乙醇定容至刻度,涡旋振荡后静置15 min,以60%乙醇为空白对照,测定反应液在510 nm的吸光度。以芦丁作标曲,计算‘修水化红’茶中的类黄酮含量。

1.2.7 ‘修水化红’皮茶挥发性风味成分的测定

1.2.7.1 顶空固相微萃取 顶空固相微萃取方法参照移兰丽等[12]进行,略有改动。称取0.1 g‘修水化红’皮粉于顶空萃取瓶中并放入转子,后立即加入12.5 mL 100 ℃刚沸腾的蒸馏水进行冲泡(冲泡时间10 min，冲泡次数1次),并用硅橡胶加盖密封,置于60 ℃恒温水浴磁力搅拌器中平衡20 min,后用已老化的DVB/CAR/PDMS 50/30 μm 3层固相微萃取头在60 ℃下萃取40 min富集‘修水化红’皮茶挥发性风味成分,萃取纤维头在GC进样口解析5 min后立即进行GC-MS分析。

1.2.7.2 气相色谱-质谱连用分析 GC-MS条件参照鲁珍等[13]的方法设置。 GC条件:J&WDB-石英毛细柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);以He为载气,恒定流速为1.0 mL/min,不分流;程序升温:初始温度40 ℃,保持4 min;然后以3 ℃/min升至50 ℃,再以5 ℃/min的速率升温至160 ℃,最后以8 ℃/min的速率升温到230 ℃,保持8 min。MS条件:电离方式为EI,电子能量70 eV;发射电流350 μA;接口温度250 ℃,离子源温度230 ℃;扫描质量范围为33～450 u。

1.2.7.3 物质鉴定 挥发性风味成分的试验数据由GC-MS分析软件系统处理完成。通过检索NIST11质谱谱库对挥发性风味化合物进行定性,正反匹配度大于80%的物质才作为鉴定结果。后根据峰面积归一化法计算出‘修水化红’皮茶中挥发性风味成分的相对含量。

1.3 数据分析

数据均重复测定3次,测定结果以平均值±标准差表示,采用Origin 8.5软件进行绘图,使用SPSS 20.0统计软件对试验数据进行方差分析,采用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 料水比对‘修水化红’皮茶总黄酮含量的影响

料水比对‘修水化红’皮茶总黄酮含量的影响如图1所示。随着料水比的增大,‘修水化红’皮茶总黄酮含量越大。在料水比1∶125 (g/mL)之前,总黄酮含量均差异显著(P<0.05),且在料水比1∶50～1∶75 (g/mL)之间,总黄酮含量变化速度最快,冲泡时料水比达到1∶125 (g/mL)后,‘修水化红’皮总黄酮含量均差异不显著(P>0.05),维持在8.0 mg RT/g DW左右。因此,1∶125 (g/mL)是‘修水化红’皮冲泡时适宜的料水比,能使‘修水化红’皮总黄酮充分浸出,若继续增大料水比冲泡,可能对‘修水化红’皮茶的滋味及风味形成有抑制的作用。随着料水比的增大,传质阻力变小,活性物质扩散速度变快,直接导致‘修水化红’皮茶总黄酮含量的增大,料水比在1∶125 (g/mL)后,黄酮扩散速率可能会不再增加,导致‘修水化红’皮茶总黄酮含量变化较小[14]。

图1 料水比对‘修水化红’皮茶总黄酮含量的影响Fig.1 Effect of ratio of material to water on the total flavonoids contents of ‘Xiushui Huahong’ peel tea注:不同小写字母表示数据差异显著(P<0.05);图2～图3同。

2.2 水质对‘修水化红’皮茶总黄酮含量的影响

水质对‘修水化红’皮茶总黄酮含量的影响见图2。从图2中可以看出,采用矿泉水冲泡的总黄酮含量最高,达7.85 mgRT/gDW,与其他5种冲泡水均差异显著(P<0.05),而采用超纯水、蒸馏水、自来水及天然水冲泡的总黄酮含量之间均差异不显著(P>0.05),具体按总黄酮含量大小排序依次为:矿泉水>纯净水>自来水>蒸馏水>天然水>超纯水。对比得出,在日常生活中,有条件可以采用矿泉水冲泡‘修水化红’皮,利于总黄酮的浸出。

图2 水质对‘修水化红’皮茶总黄酮含量的影响Fig.2 Effect of water quality on the total flavonoids contents of ‘Xiushui Huahong’peel tea

尹军峰[15]在研究水质对龙井茶品质成分的影响时发现，采用矿泉水冲泡龙井茶的芦丁含量略高于纯净水,在本研究中也得到了类似的结论,采用矿泉水冲泡的‘修水化红’皮总黄酮含量最高,其次是纯净水。活性物质的浸出量高低主要可能与饮用水的pH及钙、镁等矿物质含量相关,矿物质可能会和活性物质发生络合反应[16],其中钙离子可以降低茶叶中苦味物质-咖啡碱在茶中的溶出,使其沉降在茶残渣中[17]。Zhang等[18]比较纯净水、自来水、矿泉水等pH与矿物质含量及其对福鼎白茶中四种主要的儿茶素溶出量影响时，发现纯净水冲泡时儿茶素含量最高,其次是矿泉水、自来水,这与本实验在‘修水化红’皮茶中的研究结果不一致,分析原因可能是不同活性物质与水中的矿物质反应结合程度不一致或不同地区与品牌的水质组成不一致。本试验仅研究了不同水质冲泡下‘修水化红’皮茶总黄酮含量的差异,关于其变化机制还有待进一步研究。

2.3 冲泡温度-时间对‘修水化红’皮茶总黄酮含量的影响

由图3可知,随着冲泡时间的延长,不同温度下‘修水化红’皮总黄酮含量均是先快速上升后逐渐稳定。在60、70、80、90、100 ℃时,当冲泡时间分别达到12、12、10、10、8 min后,‘修水化红’皮总黄酮含量差异不显著(P>0.05)。

图3 冲泡温度-时间对‘修水化红’皮茶总黄酮含量的影响Fig.3 Effect of brewing temperature and time on the total flavonoids contents of ‘Xiushui Huahong’ peel tea

冲泡温度是影响总黄酮浸出的主要因素。本试验中,在相同冲泡时间下,不同冲泡温度下的‘修水化红’皮总黄酮含量表现出较大的差异。Castiglioni等[19]研究冲泡水温对5种茶叶总黄酮浸出的影响时发现,90 ℃,7 min冲泡条件下的5种茶总黄酮含量均显著(P<0.05)高于70 ℃,7 min条件下,这与本研究结果类似。Liu等[20]研究了冲泡温度、时间、料水比、原料粒度等对绿茶功能活性物质的含量时发现,增大冲泡温度和延长冲泡时间均能提高黄酮类物质含量的浸出,也与本论文研究结果相同。相同冲泡时间下的总黄酮浸出量随着冲泡温度的上升而增大,分析原因可能是温度的上升促进分子间的运动而利于修水化红皮总黄酮的浸出,也有可能是温度上升促进了黄酮类物质的溶解度变大[21]。

总体上,提高冲泡温度和适当延长冲泡时间有利于‘修水化红’皮总黄酮的浸出。

表1 不同温度下冲泡时间与‘修水化红’皮茶总黄酮含量的关系Table 1 Relationship between different brewing time and total flavonoids content of ‘Xiushui Huahong’peel tea under different temperature

2.4 冲泡温度-次数对‘修水化红’皮茶总黄酮含量的影响

从表2可以看出,随着冲泡次数的增多,不同冲泡温度下的‘修水化红’皮总黄酮含量均呈降低的趋势。60 ℃下,第4次冲泡后总黄酮含量差异不显著(P>0.05),维持在较低水平,前3次总黄酮总量为6次浸出总量的95.62%,而在70、80、90、100 ℃下,第5次冲泡后总黄酮含量表现出不显著的差异(P>0.05),维持在较低水平,前4次总黄酮总量分别为6次浸出总量的98.17%、95.47%、95.38%、98.27%。在第1次～第3次冲泡时,总黄酮含量随着温度的增加也逐渐升高,但在第4次～第6次冲泡时,随着温度的升高,‘修水化红’皮茶总黄酮含量先呈上升的趋势,随后降低。总体而言,‘修水化红’皮冲泡次数过多,总黄酮含量降低,此外可能还会影响茶的风味及口感。

表2 冲泡温度-次数对‘修水化红’皮茶总黄酮含量的影响Table 2 Effect of brewing temperature and times on the total flavonoids contents of ‘Xiushui Huahong’peel tea

表3 不同温度下冲泡次数与‘修水化红’皮茶总黄酮含量的关系Table 3 Relationship between different brewing times and total flavonoids contents of ‘Xiushui Huahong’peel tea under different temperature

2.5 ‘修水化红’皮茶挥发性风味成分的鉴定

本文在‘修水化红’皮茶中共鉴定出39种风味物质,结果见表4。在39种挥发性风味成分中,D-柠檬烯相对含量最高,达42.37%,其次是芳樟醇,达20.45%,相对含量最低的是正十六烷,仅为0.18%。从表5可以看出,‘修水化红’皮茶挥发性风味物质主要包括萜烯烃类、烷烃类、醇类、醛类、酯类及酮类等6类化合物,主要是萜烯烃类和醇类,相对含量分别为51.79%、33.12%,在‘修水化红’皮茶整体风味的呈现中发挥较为重要的作用。在茶挥发性风味成分中,鉴定出两种酮类物质,相对含量仅为1.07%,但其中不饱和酮类的6-甲基-5-庚烯-2-酮,具有新鲜的清香和典型的柑橘香气,香味持久。此外,在‘修水化红’皮茶中还鉴定出4种烷烃类物质,总相对含量达1.89%,但其香气较淡甚至无香气,对于‘修水化红’皮茶整体风味的呈现作用较低。

表4 ‘修水化红’皮茶挥发性风味成分分析Table 4 Analysis of volatile flavour compounds of ‘Xiushui huahong’ peel tea

表5 ‘修水化红’皮茶挥发性风味成分种类及相对含量Table 5 Types and contents of volatile flavour compounds of ‘Xiushui Huahong’ peel tea

‘修水化红’皮茶的挥发性风味主要来源于‘修水化红’皮本身的香气及冲泡过程中产生的风味。当前研究中,对柑橘皮冲泡香气研究较少,本试验首次采用HS-SPME-GC-MS鉴定出‘修水化红’皮茶挥发性风味成分，同大部分柑橘鲜样及干制品相同,萜烯烃类也是‘修水化红’皮茶主要的挥发性风味成分,其中D-柠檬烯含量最高。在‘修水化红’皮茶中,鉴定出了右旋香芹酮和α-松油醇,其相对含量分别为0.45%、5.25%。研究表明右旋香芹酮、α-松油醇分别是D-柠檬烯与芳樟醇的降解产物,会产生不愉快的风味,对柑橘的整体风味起到负面的影响[22]。张弛等[23]认为热处理会促进蜜柑汁α-松油醇的相对含量增加,因此推测‘修水化红’皮茶中高相对含量的α-松油醇可能是热冲泡或‘修水化红’皮干燥过程产生的。研究表明一些醇类物质具有令人欢悦的香气,其中不饱和醇的香气阈值较低,对物料整体的香气贡献较大[24],在‘修水化红’皮茶挥发性风味成分中,萜烯醇类的芳樟醇相对含量又高,达20.45%,能赋予茶典型的柔和香味。此外,‘修水化红’皮茶中鉴定出相对含量达2.35%的酯类物质,其能赋予‘修水化红’皮茶独特的酯香气,产生比较柔和的果香味[25]。

3 结论

综上所述,冲泡料水比、水质、冲泡温度、冲泡时间、冲泡次数均能在不同程度影响‘修水化红’皮茶的总黄酮含量。在冲泡料水比1∶125、水质为矿泉水、100 ℃沸水等条件下冲泡‘修水化红’皮8～10 min后，饮用茶中总黄酮含量高。不同温度下,冲泡时间、冲泡次数与‘修水化红’皮茶总黄酮含量的关系可以用回归方程拟合,根据冲泡条件可以预测茶总黄酮含量。在100 ℃沸水冲泡的‘修水化红’皮茶中共鉴定出39种风味物质,其中以D-柠檬烯相对含量最高,挥发性风味物质主要包括萜烯烃类、烷烃类、醇类、醛类、酯类及酮类等6类化合物,主要是萜烯烃类和醇类。

总黄酮含量和挥发性风味成分是影响‘修水化红’皮茶生物活性及口感风味的主要组分。本研究阐述了‘修水化红’皮在冲泡过程中的总黄酮含量变化规律及其茶汤的挥发性风味成分组成,可为科学冲泡‘修水化红’皮和饮茶提供实践性指导,也可为‘修水化红’皮茶饮料的加工和茶汤滋味风味成分提供一定的理论依据,最终促进‘修水化红’果实的开发利用和当地经济的可持续发展。本论文仅仅研究了黄酮和挥发性风味成分在冲泡过程中的变化,后续将继续研究氨基酸、色素、多酚、多糖等成分在‘修水化红’皮冲泡过程中变化规律,并分别对比研究‘修水化红’皮冲泡香气、茶汤香气、茶底香气、干茶香气及冲泡过程中挥发性风味成分变化,同时开展‘修水化红’皮冷泡茶工艺研究,最终提高‘修水化红’皮茶汤品质并发挥其冲泡价值。