驼乳与牛乳乳清蛋白酶解工艺优化及其产物抗氧化能力分析

2020-07-20郝晓丽吉日木图

食品工业科技 2020年13期

郝晓丽,张霞,李磊,何静,吉日木图,2,*

(1.内蒙古农业大学，乳品生物技术与工程教育部重点实验室,内蒙古呼和浩特 010018; 2.内蒙古骆驼研究院,内蒙古巴丹吉林 737300)

驼乳和牛乳中含有丰富的蛋白质,如免疫球蛋白、乳铁蛋白及各种生长因子;也含有人体所必需的氨基酸、多种维生素、矿物质。因此,不仅能够给人体提供高的营养价值,还有调节人体代谢、提高机体免疫力和抗感染能力[1]。但是存在对动物乳清的利用率较低的问题,因此为了能够更大程度地发挥其作用,研究人员开始对其乳清蛋白进行酶解。目前对牛乳清酶解制备活性多肽的研究颇多,研究人员发现,牛乳乳清蛋白酶解后可得到含有抗氧化能力、抗高血压和抗菌能力的活性多肽[2-3]。酶解后的乳清蛋白酶解物具有有效增加糖原的储存[4]、降低肌酸激酶水平[5]、增强细胞存活相关因子[6]、促进动物骨骼肌的保护[7-8]、增加细胞抵抗力[9],并防止活性氧的积累降低细胞毒性的能力[10]。但是对驼乳乳清蛋白酶解物的研究相对较少,驼乳相比较于牛乳,驼乳清中含有更多的抗菌因子,如溶菌酶、扁桃体和免疫球蛋白等[11]。骆驼乳清含有一些免疫调节蛋白,如血清白蛋白、α-LA、乳酸和肽聚糖,这些天然存在的蛋白也是乳清蛋白初级序列的一部分[12],是抗氧化肽的良好来源。迄今为止,针对驼乳蛋白水解物的研究,主要集中于其抗氧化性[13]、降糖[14]、血管紧张素转换酶ACE抑制性[15]和抗菌活性的作用[12]。

目前,学者们针对单一动物乳乳清蛋白酶解制备活性多肽的研究较多,并且主要集中于牛乳乳清蛋白的酶解上,Gashaw[16]和Gomez-Ruiz等[17]通过微生物发酵法制备出具有抗氧化能力的多肽。而Peng等[18]使用Alcalase蛋白酶对乳清蛋白进行酶解以制备高抗氧化活性的多肽,并确定了高抗氧化活性肽段的分子量。沈邑等[19]经胰蛋白酶水解牛乳乳清蛋白得到具备较高抗氧化肽。除此之外,温禄云等[20]将碱性蛋白酶与复合风味蛋白酶复合水解乳清蛋白得到水解度高、苦味小的多肽。Moslehishad等[21]研究发现,相比较胰蛋白酶,碱性蛋白酶等，木瓜蛋白酶是纯天然的,安全性更高,使用木瓜蛋白酶酶解后的多肽具有较高的抗氧化性。对于驼乳乳清蛋白抗氧化肽的研究相对较少,目前主要研究对象是驼乳乳蛋白及驼乳酪蛋白,而乳清蛋白在乳中占有较大的比重,并且具有较高的营养价值,乳清蛋白中的生物活性因子表现出较强的抗氧化活性。同时,目前的研究对不同动物乳乳清蛋白酶解制备活性多肽的比较分析的报道较少。因此本文对研究最为广泛的牛乳和研究相对较少的驼乳乳清蛋白的生物活性肽进行比较研究。

本研究通过采用不同蛋白水解酶分别对驼乳和牛乳乳清蛋白进行酶解,筛选出水解度高的蛋白水解酶进行酶解工艺优化试验,并以DPPH自由基清除率为指标来确定最佳酶解条件,通过抗氧化性、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将驼乳乳清蛋白酶解液与牛乳乳清蛋白酶解液进行比较分析,充分验证驼乳乳清蛋白酶解液和牛乳乳清蛋白酶解液的抗氧化活性,并将二者进行抗氧化性的对比分析,为进一步研究二者的差异特点奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

骆驼乳、牛乳、木瓜蛋白酶(6000 U/g)、胰蛋白酶(250 U/g)、中性蛋白酶(50000 U/g)、羟自由基清除能力检测试剂盒、超氧阴离子清除能力检测试剂盒、彩虹245plus光谱蛋白Marker、SDS-PAGE凝胶预混液(15%)、蛋白上样缓冲液北京索莱宝科技有限公司北京索莱宝科技有限公司;邻苯二甲醛(o-Phthalaldehyde,OPA,纯度为97%) 天津市光复精细化工研究所;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-Trinitrophenylhydrazine,DPPH) 美国Sigma公司;无水乙醇国产分析纯。

JC-HH-S26 恒温水浴锅济南精诚实验仪器有限公司;5810R高速冷冻离心机德国艾本德股份公司;SYNERGY H1酶标仪 BioTek Instruments,Inc;PL303电子天平梅特勒-托利多仪器有限公司;PB-10数字酸度计德国赛多利斯公司;SCIENTZ-10N冷冻干燥机宁波新芝生物科技股份有限公司;Biorad Mini-PROTEAN Tetra Cells伯乐小型垂直电泳槽伯乐生命医学产品有限公司;自动凝胶成像分析系统GelDoc-It2Endress+Hauser有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 驼乳、牛乳乳清蛋白的提取及纯化将驼乳和牛乳分别经离心脱脂(10000 r/min,15 min,4 ℃)后,使用1 mol/L HCl溶液调整pH至pH4.6进行酪蛋白沉淀,离心(8000 r/min,20 min,4 ℃)后取上清液。将上述乳清移入透析袋(截留分子质量为8000～14000 Da),留1/3～1/2的空间,4 ℃条件下透析24 h。每隔1～2 h 更换一次透析液。将上述透析液于-80 ℃冷冻,24 h后于冷冻干燥机(-20 ℃,10 Pa)进行干燥,在压力小于10 Pa真空冷冻干燥,得到驼乳和牛乳乳清蛋白粉。

1.2.2 驼乳、牛乳乳清蛋白酶解液的制备将冷冻干燥制成的驼乳和牛乳乳清蛋白冻干粉配制成一定浓度的反应底物,水浴加热(酶适宜温度)5 min。用0.5 mol/L NaOH溶液调节反应底物至酶解反应适宜的pH后,加入适量蛋白酶,启动酶解反应。待酶解完成后,沸水浴10～15 min将酶灭活,8000 r/min冷冻离心30 min后,-20 ℃冰箱冷冻保存备用。

1.2.3 蛋白酶的筛选实验选取木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶进行试验,将驼乳和牛乳乳清蛋白复溶为底物浓度3%的溶液,在pH7,温度为45 ℃,酶与底物比3%的条件下酶解4 h,测定其水解度,筛选出能最大程度水解乳清蛋白的蛋白水解酶进行酶解工艺的优化试验。

1.2.4 单因素实验实验控制酶解温度50 ℃,酶解pH7.0,酶解时间4 h,酶与底物比3%,底物浓度3%,分别以酶解pH(5、6、7、8、9)、底物浓度(1%、2%、3%、4%、5%)、酶解时间(2、3、4、5、6 h)、酶与底物比(1%、2%、3%、4%、5%)、酶解温度(40、45、50、55、60 ℃)为影响因素分别对驼乳乳清蛋白粉和牛乳乳清蛋白粉进行单因素实验,并检测上述因素对DPPH自由基清除率的影响,以用于抗氧化肽的制备。

1.2.5 响应面试验根据单因素实验选取酶解pH、酶解温度和底物浓度3个因素,以DPPH自由基清除率为响应值,根据Box-Behnken试验设计原理,设计17个试验点的响应面分析试验,以确定最佳酶解工艺。响应面试验因素水平见表 1。

表1 响应面酶解乳清蛋白试验因素与水平表Table 1 Factors and levels of response surface enzymatic whey protein test

1.2.6 驼乳、牛乳乳清蛋白水解液水解度的测定采用邻苯二甲醛(OPA)法测定蛋白质水解度[22]。200 mg SDS,7.62 g四硼酸钠,160 mg OPA,4 mL乙醇和176 mg DTT定容到200 mL容量瓶中,即为OPA试剂,需避光冷藏。将400 μL丝氨酸溶液(标准溶液)、去离子水(空白溶液)和驼乳多肽溶液(样品溶液)加入到装有3 mL OPA试剂的试管中,混合均匀(5 s)后,精确静置2 min立即读取340 nm对应的吸光值。计算公式为:DH(%)=h/htot×100

式中:DH为蛋白质水解度(%);h为被水解的肽键数(meqv/g);htot为蛋白质总肽键数(8.2 meqv/g)。

1.2.7 驼乳、牛乳乳清蛋白水解液抗氧化能力的测定

1.2.7.1 对DPPH·清除能力的测定参照邓晓阳等[23]的方法,称取3.9 mg DPPH溶于无水乙醇中,避光条件下定容至100 mL棕色容量瓶中,配制为1×10-4mol/L的DPPH无水乙醇溶液。取2 mL样品与2 mL浓度为1×10-4mol/L的DPPH无水乙醇溶液混合均匀,室温条件下,避光反应30 min。在517 nm波长处测定反应物吸光度值Ai。DPPH自由基的清除率公式为:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100

式中:Ai:2 mL样品加2 mL DPPH乙醇溶液的吸光度值;Aj:2 mL样品加2 mL蒸馏水的吸光度值;Ao:2 mL DPPH溶液加 2 mL 乙醇溶液的吸光度值。

1.2.7.2 对·OH清除能力的测定按照试剂盒说明进行加样,混匀后37 ℃反应60 min,10000 r/min离心10 min后用蒸馏水将仪器调零,立即取200 μL于96孔板中测定OD536吸光值。·OH的清除率公式为:

OH自由基清除率(%)=(A测-A对)/(A空-A对)×100

式中:A测:样品的吸光度值;A对:对照标准品的吸光度值;A空:空白管的吸光度值。

式中:A测:样品的吸光度值;A对:对照标准品的吸光度值。

1.2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳利用SDS-PAGE方法[24]对驼乳和牛乳乳清蛋白以及驼乳和牛乳乳清蛋白酶解液进行电泳检测。分别配制15%分离胶、5%浓缩胶,将乳清蛋白粉复溶为3%的溶液,并将其与蛋白上样缓冲液按4∶1稀释后备用。将胶片制好后装入电泳槽,倒入电极缓冲液后进行上样。标准蛋白分子Marker和样品的上样量均为5 μL,然后开始电泳。将电压调至90 V,进入分离胶后调为120 V,当条带到达玻璃板底部上方1 cm处即可结束电泳。将胶片取出后用考马斯亮蓝染色液进行染色,再用脱色液脱色至条带清晰即可在凝胶成像仪上拍照。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选结果

如图1所示,驼乳和牛乳乳清蛋白经不同蛋白酶水解后其水解度各不相同,驼乳乳清蛋白的水解度普遍高于牛乳乳清蛋白,三种酶相比较而言,经木瓜蛋白酶水解后水解度显著高于胰蛋白酶和中性蛋白酶(P<0.05),驼乳乳清蛋白经木瓜蛋白酶水解后的水解度达到15%,显著高于经胰蛋白酶和中性蛋白酶水解后的水解度(P<0.05);而牛乳乳清蛋白经木瓜蛋白酶水解后的水解度为3.7%,显著高于其他两种蛋白水解酶水解后的水解度(P<0.05)。因此,选用木瓜蛋白酶对驼乳和牛乳进行酶解条件的优化。分组如下:CEH为驼乳乳清蛋白酶解液;MEH为牛乳乳清蛋白酶解液。

图1 不同蛋白酶对水解度的影响Fig.1 Effect of different proteases on hydrolysis degree注:不同字母表示同一样品不同蛋白酶水解条件下的差异显著水平(P<0.05)。

2.2 驼乳和牛乳乳清蛋白酶解工艺单因素实验结果

2.2.1 酶解pH对驼乳和牛乳乳清蛋白酶解液抗氧化性的影响将驼乳和牛乳乳清蛋白粉在不同pH条件下进行酶解,并测定其抗氧化性DPPH自由基清除率。驼乳和牛乳乳清蛋白酶解液DPPH自由基清除率变化如图2所示。随着pH的增加,驼乳和牛乳乳清蛋白酶解液DPPH自由基清除率总体均呈现先升高后降低的趋势,当pH达到7时,DPPH自由基清除率均达到最高,驼乳乳清酶解液的DPPH自由基清除率达到61.5%,牛乳乳清酶解液DPPH自由基清除率略低于驼乳,最高为54.5%。随着pH的增加,酶活降低,DPPH自由基清除率随后开始降低,因此当pH为7时,驼乳和牛乳乳清蛋白酶解液具有最高的DPPH自由基清除率,此时是酶解pH的最优条件。

图2 酶解pH对乳清蛋白酶解液抗氧化性的影响Fig.2 Effects of enzymolysis pH value on antioxidant activity of whey protease enzymatic hydrolysate

2.2.2 底物浓度对驼乳和牛乳乳清蛋白酶解液抗氧化性的影响将不同底物浓度的驼乳和牛乳乳清蛋白酶解后进行抗氧化性DPPH自由基清除率的测定,结果如图3所示,随着底物浓度的增加,驼乳和牛乳乳清蛋白酶解液的抗氧化性DPPH自由基清除率均呈现先上升后下降,当底物浓度为3%时,DPPH自由基清除最高,驼乳和牛乳乳清蛋白酶解液的DPPH自由基清除率分别为60.2%、58.4%。随着底物浓度的增加,酶的水解能力有限,无法释放更多的抗氧化多肽,反而可能抑制其活性[20],从而降低酶解液的抗氧化性,因此当底物浓度为3%时,能够得到DPPH自由基清除率最高的酶解液。

图3 底物浓度对乳清蛋白酶解液抗氧化性的影响Fig.3 Effects of substrate concentration on antioxidant activity of whey protease enzymatic hydrolysate

2.2.3 酶解时间对驼乳和牛乳乳清蛋白酶解液抗氧化性的影响驼乳和牛乳乳清蛋白经不同时间酶解后抗氧化性DPPH自由基清除率结果如图4所示,随着酶解时间的增加,驼乳和牛乳乳清蛋白酶解液的抗氧化性DPPH自由基清除率先上升后下降,当酶解时间为4 h时,驼乳和牛乳乳清酶解均有最高的抗氧化性,DPPH自由基清除率分别达到62.6%和58.4%,当酶解时间持续增加,驼乳和牛乳乳清酶解液不同程度的下降,乳清蛋白经长时间的酶解后会发生变性,反而降低了酶解液的抗氧化性。因此酶解时间选择4 h最为合适。

图4 酶解时间对乳清蛋白酶解液抗氧化性的影响Fig.4 Effects of enzymolysis time on antioxidant activity of whey protease enzymatic hydrolysate

2.2.4 酶与底物比对驼乳和牛乳乳清蛋白酶解液抗氧化性的影响驼乳和牛乳乳清蛋白添加不同量的木瓜蛋白酶反应后酶解液的DPPH自由基清除率结果如图5所示,酶添加量对驼乳和牛乳乳清蛋白酶解液抗氧化性DPPH自由基清除率有一定的影响,总体呈现先上升后趋于平稳的趋势。二者均在酶与底物比为3%时有最好的抗氧化性,驼乳乳清蛋白酶解液最高可达61.5%,牛乳乳清蛋白酶解液最高为59.7%。随着蛋白水解酶的增加,底物浓度不变,水解效果无明显变化,因此酶解液的抗氧化性无明显的提高。因此,酶与底物比为3%时较为合适。

图5 酶与底物比对乳清蛋白酶解液抗氧化性的影响Fig.5 Effects of enzyme substrate ratio on antioxidant activity of whey protease enzymatic hydrolysate

2.2.5 酶解温度对驼乳和牛乳乳清蛋白酶解液抗氧化性的影响将驼乳和牛乳乳清蛋白在不同温度下进行酶解并进行抗氧化性DPPH自由基清除率的测定,结果如图6所示,驼乳乳清蛋白酶解液的总体趋势是先上升后下降,在50 ℃时其DPPH自由基清除能力最高,为60.9%;牛乳乳清蛋白酶解液在40～60 ℃范围内其DPPH自由基清除能力变化幅度较小,最低为44.0%,最高达到56.4%,同样也是在50 ℃条件下进行酶解其抗氧化能力最强。随着温度的不断增加,蛋白水解酶的活性受到抑制,水解成度降低,酶解液的抗氧化性呈现下降的趋势[23]。因此,酶解温度为50 ℃较为合适。

图6 酶解温度对乳清蛋白酶解液抗氧化性的影响Fig.6 Effects of enzymolysis temperature on antioxidant activity of whey protease enzymatic hydrolysate

2.3 驼乳和牛乳乳清蛋白酶解工艺响应面试验结果

2.3.1 响应面设计及结果驼乳和牛乳乳清蛋白分别对最佳酶解条件附近值影响酶解效果较大的因素酶解温度(A)、酶解pH(B)和底物浓度(C)进行响应面试验,并以抗氧化性DPPH自由基清除率为响应指标,得到的试验方案和结果见表2。

表2 驼乳和牛乳乳清蛋白响应面试验设计及结果Table 2 Program and experimental results of Box-Behnken test of camel and bovine milk whey protein

通过Design-Expert v8.0.6软件分析试验结果得到驼乳乳清蛋白酶解液的DPPH自由基清除率与酶解温度(A)、酶解pH(B)和底物浓度(C)方程为Y=60.36+2.99A-5.85B-9.39C-12.12AB-0.45AC-5.03BC+0.20A2-13.83B2-12.51C2。牛乳乳清蛋白酶解液的方程为Y=58.82+3.96A-15.21B+2.98C-2.13AB+0.30AC-4.65BC-3.90A2-9.30B2-1.82C2。

表3 驼乳乳清酶解液回归方程方差分析Table 3 Analysis of variances for the developed regression equation of camel milk whey protein

酶解pH和底物浓度的交互项影响效果显著(P<0.05),酶解pH和底物浓度的二次项对响应值的影响均极显著(P<0.01)。

表4 牛乳乳清酶解液回归方程方差分析Table 4 Analysis of variances for the developed regression equation of bovine milk whey protein

2.3.2 交互作用分析通过各因素的交互作用的等高线图和曲面图可直观反映其对抗氧化作用的影响[25]。由图7可知,随着pH的增加,DPPH自由基清除率呈现先增加后下降的趋势;随着温度的升高,DPPH自由基清除率略微上升,但变化不明显;随着底物浓度的增加,DPPH自由基清除率先上升后下降。由等高线形状[26]可知,酶解pH与酶解温度的交互作用显著,其次为酶解pH与底物浓度,酶解温度与底物浓度的交互作用最不显著,这与表4显示结果一致。

图7 驼乳乳清酶解液各因素交互作用的响应面图Fig.7 Response surface plots of the interaction effects of various parameters of camel milk whey protein

由图8可知,对牛乳乳清蛋白酶解液影响最大的是酶解pH,随着pH的升高,其抗氧化性DPPH自由基清除率下降,而酶解温度和底物浓度影响较小。酶解pH和底物浓度的交互作用最为显著,陡峭程度最大,而酶解温度和底物浓度交互作用的曲面陡峭程度最小,影响程度最小[27],与方差分析结果一致。

图8 牛乳乳清酶解液各因素交互作用的响应面图Fig.8 Response surface plots of the interaction effects of various parameters of bovine milk whey protein

2.3.3 验证试验及结果驼乳乳清蛋白酶解优化通过响应试验得出,最佳酶解条件为酶解pH6.4,酶解温度55 ℃,底物浓度2.73%,在此条件下DPPH自由基清除率预测值为73.29%。按照最优推荐条件进行试验测得驼乳乳清蛋白酶解液的DPPH自由基清除率为71.90%±0.01%,与方程预测值误差较小。牛乳乳清蛋白酶解优化通过回归方程求解得到最佳酶解条件为酶解pH6.0,酶解温度54 ℃,底物浓度4%,在此条件下DPPH自由基清除率预测值为70.15%。依照所选最优酶解条件进行酶解试验后测得的牛乳乳清蛋白酶解液的DPPH自由基清除率为69.90%±0.02%,与预测值几乎一致,证明试验效果较好。

2.4 驼乳和牛乳乳清蛋白酶解液的抗氧化性

图9 乳清蛋白的抗氧化能力Fig.9 Antioxidant capacity of whey protein注:不同字母表示组间(同一抗氧化指标) 差异显著(P<0.05)。

2.5 驼乳和牛乳乳清蛋白酶解液SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

如图10所示,驼乳乳清蛋白与牛乳乳清蛋白最大的区别就在于驼乳乳清蛋白中不含有致敏性成分β-乳球蛋白,驼乳乳清蛋白中的大分子的溶菌酶、α-乳清蛋白、血清白蛋白和乳铁蛋白,牛乳乳清蛋白中的溶菌酶、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白分子量均在10 kDa以上,经过4 h的酶解后,均被完全水解为小分子组分,分子量均小于10 kDa,充分验证了酶解反应已进行完全,乳清中的大分子蛋白已经被水解为小分子的肽。