卜俊芝,徐 迅,严利强

(浙江旅游职业学院,浙江杭州 311231)

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是一种重要的海洋经济动物,由于其个体大、生长快、风味鲜美、营养丰富等特点,已经在我国海洋捕捞和海水养殖中占有极其重要的地位。其蟹肉的脂肪富含不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acids,UFA),含量高达40%,尤其是C20∶5n3(EPA)和 C22∶6n3(DHA)[1]。有研究表明饱和脂肪酸(saturated fatty acids,SFA)会引起血清总胆固醇升高,单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acids,MUFA)却具有保护心脏、降血糖、调节血脂、降低胆固醇和防止记忆下降等诸多作用[2],同时多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)有降血脂防动脉硬化、提高人体免疫机能等重要功能[3]。可是,我国相关梭子蟹产品主要是新鲜梭子蟹和剥制的蟹肉,对梭子蟹的加工还处于简单的初级阶段，对蟹肉脂肪还没有进一步的精深加工。随着我国国民生活水平的提高,市场对蟹产品的多样化提出了更高要求。

目前,有关三疣梭子蟹的研究大多集中于养殖技术[4-7]和基础的营养及风味研究[1,8-10]。进一步针对三疣梭子蟹脂肪的研究极少[1，10]。脂肪分析方法常用索氏提取、氯仿甲醇法、稀碱水解法、酶法等[11-16]脂肪提取方法和脂肪酸的酸碱酯化法[17-20]。由于实验条件的限制,不同实验室采取的提取和甲酯化方法各异,使用的溶剂亦种类繁多,这对脂肪酸测定结果造成的影响千差万别,很难实现脂肪酸的准确测定。螃蟹脂肪酸分析方法的标准化,有利于不同海域螃蟹脂肪酸的对比研究以及促进螃蟹的精深加工。

因此,针对三疣梭子蟹肥美的脂肪,本文将常用的4种脂肪提取方法及5种常见甲酯化方法进行了系统的比较,找出最适合螃蟹脂肪的提取及分析方法,从而获得三疣梭子蟹的蟹肉脂肪酸组成特征,期望为三疣梭子蟹的营养研究提供理论数据,也为水产品脂肪精深加工提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜的雄性三疣梭子蟹 捕捞于浙江舟山海域,选取大小均匀,体重均200 g。

石油醚(沸程:60～90 ℃)、丙酮、氯仿、甲醇(提取脂肪) 分析纯,成都市科龙化工试剂有限公司;三氟化硼(脂肪酸甲酯化，分析纯)、正己烷(提取甲酯化的脂肪，色谱纯) 国药集团化学试剂有限公司;37种脂肪酸甲酯标准品 色谱纯,上海Sigma-aldrich公司。

Agilent GC-7890A气相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司;离心机 美国赛默飞世尔公司;XH-MC-1 实验室微波合成仪 上海祥鸽智能科技有限公司;IKA®T18均质机 上海楚柏实验室设备有限公司;N-EVAP111 氮吹仪 北京康林科技有限公司;JB-3型定时恒温磁力搅拌器 上海雷磁新泾仪器有限公司;RE-52 AAA 旋转蒸发器 上海嘉鹏科技有限公司;PTS-300超声发生器 广州东方超声设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 脂肪酸甲酯标准溶液的配制 37种脂肪酸甲酯标准品用色谱纯正己烷稀释5倍,过0.45 μm有机滤膜后进气相色谱分析。

1.2.2 三疣梭子蟹样品的前处理 三疣梭子蟹冰浴条件下运到实验室,立即清洗干净后,蒸20 min,去除鳃、胃、心、肠、性腺,剪开步足和头胸甲底部内骨骼,刮出肌肉作为蟹肉,并在冰浴的条件下均质,真空包装。样品置于冰箱冷冻室中(-20 ℃)保存。

1.2.3 三疣梭子蟹脂肪提取方法 梭子蟹的脂肪提取参照如下不同的提取方法提取,得到的粗脂肪测定脂肪得率。利用常规三氟化硼-甲醇甲酯化后,气相色谱进行分析,得到饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸相对百分含量。

1.2.3.1 索氏提取法 参照王洪英等[11]的方法,具体方法如下。新鲜蟹肉去水处理,取蟹肉(干样)10 g,滤纸封好放于索氏提取器中,提取溶剂为丙酮-石油醚溶液(1∶1,v/v),料液比为1∶6 g/mL,于75 ℃恒温水浴回流8 h,真空旋转蒸发去除有机溶剂,得到粗脂肪,测定其脂肪提取率。充氮气密封4 ℃保存。甲酯化方法采用一步BF3法处理。

1.2.3.2 Bligh-Dyer提取法 参照刁全平等[12]的方法,具体方法如下。称取蟹肉(湿样)20 g于500 mL锥形瓶中,加入100 mL甲醇、50 mL氯仿、40 mL蒸馏水,均质后,磁力搅拌器搅拌20 h,加入50 mL氯仿,50 mL蒸馏水,真空抽滤,取下层有机相,旋转蒸发去除氯仿,得到粗脂肪,测定其脂肪提取率。充氮气密封4 ℃保存。甲酯化方法采用一步BF3法处理。

1.2.3.3 超声提取法 参照汪学荣等[13]的方法,具体方法如下。称取蟹肉(湿样)20 g于500 mL锥形瓶中,以甲醇-氯仿-水(1∶1∶0.9,v/v/v)作为溶剂,固液比1∶5 g/mL,均质后静置20 h,以超声功率400 W、超声时间25 min,重复超声3次,混合提取液,5000 r/min离心5 min,取下清液,旋转蒸发去除氯仿,得到粗脂肪,测定其脂肪提取率。充氮气密封4 ℃保存。甲酯化方法采用一步BF3法处理。

1.2.3.4 微波萃取法 参照李朝阳等[14]的方法,具体方法如下。称取蟹肉20 g(湿样)于250 mL锥形瓶中,提取溶剂用无水乙醇-石油醚(4∶1,v/v),料液比为1∶5 g/mL,微波辐射功率640 W,设定温度为40 ℃,辐射时间60 s,萃取后磁力搅拌40 min,真空抽滤,取上层有机相,旋转蒸发去石油醚,得到粗脂肪,测定其脂肪提取率。充氮气密封4 ℃保存。甲酯化方法采用一步BF3法处理。

1.2.4 三疣梭子蟹脂肪酸甲酯化处理方法 粗脂肪均由同样的Bligh-Dyer方法抽提得到,分别用经优化后的5种甲酯化方法进行甲酯化,然后进气相色谱进行分析,得到各类脂肪酸的相对百分含量。

1.2.4.1 酸法甲酯化 参照傅向乾等[17]的方法,具体方法如下。取蟹油粗品20 mg,加入1%硫酸-甲醇(V/V)2 mL,70 ℃水浴加热60 min,加2 mL正己烷,混匀,静置分层,收集上清液,加适量无水硫酸干燥,经氮吹浓缩后进气相分析得到脂肪酸组成结果。

1.2.4.2 室温碱法甲酯化 参照傅向乾等[17]的方法,具体方法如下。取蟹油粗品20 mg,加入石油醚-苯混合溶剂(1∶1,v/v)2 mL溶解脂肪,加2 mL 0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液,超声频率30 kHz,反应时间10 min,室温静置30 min,加蒸馏水1 mL,振摇,静置分层后取上层,加适量无水硫酸钠干燥后,经氮吹浓缩后进气相分析得到脂肪酸组成结果。

1.2.4.3 酸碱酯化法 参照张述琼等[19]的方法,具体方法如下。取蟹油粗品20 mg,加入0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液4 mL,于60 ℃水浴中皂化至无油滴(约20 min)。冷却到室温,滴加50%硫酸调节溶液呈中性,加入8 mL 1%硫酸-甲醇溶液酯化反应30 min,取出冷却至室温,加入5 ml正己烷,加入2 mL饱和NaCl,振摇,静置分层取上层,用无水硫酸钠干燥后,经氮吹浓缩后进气相分析得到脂肪酸组成结果。

1.2.4.4 常规三氟化硼(BF3)-甲醇法 参照符贵红等[18]的方法,具体方法如下。取蟹油粗品20 mg,加入0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液3 mL,充氮气混匀,65 ℃水浴中皂化20 min,冷却至室温,加4 mL BF3-甲醇(14%,w/v)混合溶液,60 ℃水浴反应5 min,取出冷却至室温,超声功率300 W,超声频率30 kHz,超声10 min,各加2 mL饱和氯化钠溶液和正己烷,振荡5 s,静置分层取上层,用无水硫酸钠干燥,经氮吹浓缩后进气相分析得到脂肪酸组成结果。

1.2.4.5 一步BF3法 参照Pedro等[20]的方法,具体方法如下。取蟹油粗品20 mg,加入2 mL BF3-甲醇溶液(14%,w/v),充氮气密封,在100 ℃恒温水浴1 h。冷却后加1 mL正己烷,2 mL蒸馏水后,振荡15 s,3000 r/min离心5 min,收集上层。下层加1 mL正己烷重新提取两次,合并上层,经氮吹浓缩后进气相分析得到脂肪酸组成结果。

1.2.5 测定方法

1.2.5.1 气相色谱测定条件 色谱柱:HP-INNOWAX毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.15 μm);程序升温条件:初温50 ℃,保持2 min,以4 ℃/min升至220 ℃,保持15 min;进样口温度250 ℃,分流比为200∶1;进样量为1 μL;载气:高纯N2;恒流:0.65 mL/min。

1.2.5.2 脂肪酸定性和定量分析 采用37种脂肪酸甲酯标准品的保留时间与试样组分峰的保留时间进行对照,确定脂肪酸总离子流图中各色谱峰归属,然后采用峰面积归一化法进行定量分析,求得各个脂肪酸在总脂肪酸中的相对百分含量。

1.2.5.3 脂肪得率的测定

式中:W表示脂肪得率,%;m0为蟹肉的湿重,g;m1为提取锥形瓶的质量,g;m2为提取锥形瓶和脂肪的总质量,g。

1.2.6 三疣梭子蟹肉脂肪酸的组成特征和营养评价 采用脂肪得率及脂肪酸总数为指标,确定最佳脂肪提取方法及酯化方法,采用最佳条件处理蟹肉脂肪,进气相分析得到脂肪酸组成结果。组成脂肪的脂肪酸种类很多,但大致分为饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)这三大类。饱和脂肪酸会引起血清总胆固醇升高,单不饱和脂肪酸却具有保护心脏、降血糖、调节血脂、降低胆固醇和防止记忆下降等诸多作用,同时多不饱和脂肪酸有降血脂防动脉硬化、提高人体免疫机能等重要功能[21]。因此本文参考文献[21-22]计算三疣梭子蟹脂肪酸致血栓形成指数(thrombogenic index,TI)和动脉粥样硬化指数(atherogenic index,AI)来评估三疣梭子蟹饱和脂肪酸对人类心血管疾病患病的影响,同时以不饱和脂肪酸含量,以及n-3/n-6系不饱和脂肪酸的比值来评估三疣梭子蟹不饱和脂肪酸对人体健康的影响。

式中:AI表示动脉粥样硬化指数;C12∶0表示C12∶0的相对含量,%;C14∶0表示C14∶0的相对含量,%;C16∶0表示C16∶0的相对含量,%;C18∶0表示C18∶0的相对含量,%;PUFAn-3表示n-3系多不饱和脂肪酸的相对含量,%;PUFAn-6表示n-6系多不饱和脂肪酸的相对含量,%。

1.3 数据分析

样品重复测定三次,所获结果用SPSS 17处理,以平均值±标准偏差(Mean±SD)表示;采用Duncan多重比较进行差异显著性分析,以P<0.05作为差异显著性判断标准;采用Origin 10.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 蟹肉脂肪提取方法

采用37种脂肪酸甲酯标准品总离子流图中各色谱峰归属,见图1。

图1 37种脂肪酸标准品的总离子流图谱Fig.1 Total ion chromatogram of 37 fatty acid standards

四种脂肪提取方法得到的三疣梭子蟹脂肪酸相对百分含量见表1。四种提取方法的得率及获得的各类脂肪酸数量见表2。由表1和表2可知,四种提取方法所得油脂成分及相对含量有所差异。Bligh-Dyer提取方法在得率和脂肪酸总个数方面有明显的优势,而且二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的含量远远高于其他三种提取方法(P<0.05)。超声提取方法的脂肪酸组成种类和Bligh-Dyer提取方法相差不大,但是DHA的含量较低,而且提取率也较低。索氏提取方法获得的脂肪酸种类最少,饱和脂肪酸含量最高(P<0.05),而且没有检测到EPA和亚麻酸。微波提取方法获得的脂肪酸中不饱和脂肪酸的比例最高(P<0.05),其中的油酸、亚油酸和亚油酸含量较高,但是EPA和DHA含量较低(P<0.05)。

表1 四种提取方法的三疣梭子蟹肉脂肪酸组成及相对含量Table 1 Fatty acid composition and relative content of Portunus trituberculatus extracted by four methods

表2 四种提取方法效果综合比较Table 2 The comprehensive comparison of the four extraction methods

索氏抽提脂肪得率低,这可能与其方法使用的溶剂丙酮极性低于其他方法所用的甲醇、乙醇有关,因为溶剂极性大小与物料脂肪的极性大小相一致,得率才会高[23]。索氏抽提获得的饱和脂肪酸含量最高,不饱和脂肪酸含量显著(P<0.05)降低,这实验结果与金春爱等[24]研究结果一致,这和索氏提取经高温回流,可能会造成多不饱和脂肪酸在提取过程中变性而减少有关。因而脂肪酸的提取方法是影响脂肪酸检测结果的一个重要因素。Bligh-Dyer法的得率约是超声的2倍,还保留了更多的多不饱和脂肪酸,这说明超声波对提取蟹肉脂肪的贡献不是非常大。这和汪学荣等[13]、赵丽华等[25]报道一致,对得率的影响最大的是料液比和提取温度,而超声功率与超声时间影响较小。微波提取方法的得率较低,可能提取操作方法需要进一步优化。

综合提取率、提取温度、提取时间、所用原料的前处理方便性,以及提取获得的多不饱和脂肪酸含量等指标考虑,得出Bligh-Dyer是最适蟹肉脂肪的提取方法。

2.2 蟹肉脂肪酸甲酯化方法比较

5种甲酯化方法获得的三疣梭子蟹肉脂肪酸组成见表3。5种甲酯化方法检测到的脂肪酸数量见表4。常见的甲酯化方法分为酸催化、碱催化、酸碱结合甲酯化和BF3甲酯化法[26]。由表3和表4可知,酸法和常规BF3得到的脂肪酸个数较多,均为20个,而且不饱和脂肪酸含量均高于碱催化甲酯化方法,而且在碱法和酸碱法催化甲酯化方法得到的结果中未发现EPA。常规BF3和酸法甲酯化比较,其EPA和DHA含量均较高,而且总不饱和脂肪酸含量显著高于其他四种方法(P<0.05)。一步BF3得到的脂肪酸总个数最多,但是其UFA含量显著低于其他四种方法(P<0.05)。

表4 五种甲酯方法的综合效果比较Table 4 Comprehensive comparison of the methyl esterification methods

不同的甲酯化方法各有其优缺点,适用对象和测定的结果也各不相同。氢氧化钾甲醇碱催化与硫酸甲醇酸催化过程中,游离脂肪酸与甲醇反应均会生成水,水会导致氢氧根自由基的生成,这些氢氧根自由基会样品中的酯和新生成的脂肪酸甲酯发生水解反应,从而削弱碱酯化效果[27]。本实验结果也表明酸甲酯化和碱甲酯化获得的脂肪酸个数、不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量均比常规BF3低。酸催化甲酯化方法和碱催化甲酯化方法相比较,前者的效果优于后两者,可能是酸催化甲酯化环境要求较温和[28],说明相对于碱性催化法来说酸性催化法能提供更加稳定的反应条件[29]。而室温碱法和酸碱法甲酯化效果相比较,后者优于前者,这说明甲酯化前的碱皂化有利于酸甲酯化。一步BF3法虽然得到的脂肪酸个数最多,同时不饱和脂肪酸的个数也最多,但PUFA含量最低,SFA含量最高,可能是加热温度过高(100 ℃),时间过长(1 h)导致多不饱和脂肪酸分解造成的。而常规BF3获得的脂肪酸种类最丰富的,不饱和脂肪酸含量高,这可能与其反应机理密切相关,盐酸的酸化调节可使反应溶液始终处于酸性条件,有利于脂肪酯化,另外BF3作为酸性催化剂,能够消耗反应体系中存在的水并形成硼酸,有利于促进甲酯化反应的正向进行,且不会破坏不饱和脂肪酸[30]。

综上所述,从实验条件要求、甲酯化效率、脂肪酸种类丰富性及不饱和脂肪酸的含量等方面考虑,常规BF3是最适蟹肉脂肪酸甲酯化方法。

2.3 三疣梭子蟹肉脂肪酸的组成特征和营养价值评价

利用Bligh-Dyer提取方法和常规BF3甲酯化方法分析三疣梭子蟹肉脂肪酸组成,总离子流图见图2,各脂肪酸组成见表5,脂肪酸的营养价值评价见表6。

表5 三疣梭子蟹肉脂肪酸组成Table 5 Fatty acid composition of Portunus trituberculatus

表6 三疣梭子蟹脂肪酸的营养价值评价Table 6 Nutritional value assessment of fatty acids in Portunus trituberculatus

图2 三疣梭子蟹脂肪酸的总离子流图谱Fig.2 Total ion chromatogram of fatty acid in Portunus trituberculatus

结果显示共检测出20种脂肪酸,碳链长度在14～23之间,C22∶6n3(DHA)、C20∶5n3(EPA)、C18∶1(油酸)和C16∶0(棕榈酸)是三疣梭子蟹蟹肉的主要脂肪酸。其中饱和脂肪酸占总脂肪酸的39.43%,单不饱和脂肪酸为16.92%,多不饱和脂肪酸为43.65%。饱和脂肪酸中含量最高的脂肪酸是C16∶0(棕榈酸,12.05%),单不饱和脂肪酸中含量最高的是C18∶1(油酸,13.07%),接着是C16∶1n7(棕榈烯酸,2.27%),多不饱和脂肪酸中含量最高的是C22∶6n3(DHA,20.24%),接着是C20∶5n3(EPA,15.49%)。各类中的特征脂肪酸和徐善良等[31]使用Bligh-Dyer提取、KOH-甲醇酯化的三疣梭子蟹肉脂肪结果相似,而且EPA和DHA在总脂肪中的比例也相近。但是总脂肪酸中含量最高的脂肪酸不同,其检测结果是C18∶1(油酸),本文为C22∶6n3(DHA),这可能是性别、摄食、生长环境和捕获季节不同有关。这结果也和Celik等[32]提出的油酸是海水蟹肉中主要单不饱和脂肪酸这一实验结果相符合。

综上所述,脂肪酸的营养价值主要指标是其中的不饱和脂肪酸的比例以及n-3系和n-6系等重要不饱和脂肪酸的含量,特别是EPA和DHA。本实验得到的三疣梭子蟹肉脂肪酸组成中不饱和脂肪酸占60.57%,尤其EPA和DHA含量高达35.71%,远高于中华绒螯蟹的5.02%[33-34]、锯缘青蟹的16.53%[35],也高于海水养殖的鲈鱼的17.1%和大黄鱼的17.1%[36]。这说明海蟹中PUFAs是主要的脂肪酸,约占总脂肪酸的50%,其中EPA和DHA含量尤其丰富,这和Celik等[32]的研究结果一致。而且三疣梭子蟹肉中n-3系不饱和脂肪酸含量高达35.72%,n-3/n-6的比值5.27，均远远高于上述几类水产品,也远高于国际粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)推荐的PUFAn-3/PUFn-6日常膳食比(0.1～0.2)[3],较高的PUFAn-3/PUFn-6能有效降低血脂,抑制血小板凝集,降低心血管疾病的发病率[37]。此外,三疣梭子蟹的脂肪酸致动脉粥样硬化指数(AI)和血栓形成指数(TI)分别为0.22和0.17,远远低于羊肉、牛肉和猪肉(AI分别是1.00、0.72、0.60;TI分别为1.58、1.06、1.37)[21],表明三疣梭子蟹的脂肪酸不饱和度高,具有降血脂、软化血管、抑制冠心病和血栓形成等功能。

3 结论

采用索氏法、Bligh-Dyer法、超声法和微波萃取法提取三疣梭子蟹脂肪酸,进而利用酸法、室温碱法、酸碱结合法、常规BF3和一步BF3方法分别甲酯化,比较各提取方法和甲酯化方法效果,结果表明Bligh-Dyer提取方法操作简便、脂肪得率最高,同时此提取方法和常规BF3-甲酯化方法在不饱和脂肪酸的种类和含量方面均显示出明显的优势。因此,Bligh-Dyer提取方法和常规BF3甲酯化方法是蟹肉脂肪酸分析的最适方法。采用此最适方法分析三疣梭子蟹脂肪酸组成,结果共检测出20种脂肪酸,其中饱和脂肪酸占总脂肪酸的39.43%,单不饱和脂肪酸为16.92%,多不饱和脂肪酸为43.65%,n-3/n-6比值为5.27,说明三疣梭子蟹肉富含n-3系不饱和脂肪酸。后续工作中将继续优化脂肪分析条件以提高三疣梭子蟹脂肪的提取率,期望能推动蟹油进一步的加工应用。