喻录容，宋小云，何先元，，黄 鹤，欧阳凯，黄英如

（1.重庆医科大学中医药学院，重庆 401331；2.中医药防治代谢性疾病重庆市重点实验室，重庆 400016）

臭茉莉来源为马鞭草科大青属植物臭茉莉Clerodendron fragrans Vent.以根、叶入药，全年可采，切制，晒干或者鲜用，性平，味苦，有祛风利湿、化痰止咳、活血消肿的功效。根可以治疗风湿性关节炎、脚气水肿、白带、支气管炎等，叶多外用治疗湿疹、皮肤搔痒等。全草中含有黄酮苷、酚类、皂苷、鞣质、黄酮类化合物［1-2］。黄酮类广泛存在于植物界，具有抗炎症、抗过敏、抑制细菌真菌病毒繁殖和寄生虫生长、防治肝病及心脑血管疾病、抗肿瘤等作用。我们对臭茉莉叶总黄酮提取工艺，1年内月周期变化规律［3-9］进行了研究，以期为臭茉莉最佳采收期提供经济效益的理论参考。

1 材 料

仪器。UV-1800型紫外分光光度计（日本岛津公司），FW177型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），TG328B型分析天平（上海精科天平仪器厂），药典筛（浙江上虞市五四仪器厂），SB-5200DT超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份公司，200W），HH-S4数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂），SHB-Ⅲ型循环水真空泵（巩义市英峪华中仪器厂），RE-52旋转蒸发仪器（上海亚荣生化仪器厂）。

试药。药材采自重庆市重庆医科大学植物园（经生药学费曜副教授鉴定为臭茉莉Clerodendron fragrans Vent.），3月15日采集的主要是顶芽，4～10月每月的15日采集顶芽后3～6位叶，去除杂质，立即烘箱60℃烘干，打成粉末过4号药典筛备用，以下粉末均同一处理方式。芦丁标准品（UV≥98%，批号130507，北京德威钠生物技术有限公司）。亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠和无水乙醇均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 检测方法建立

对照品溶液：精密称取105 ℃下烘干至恒重的芦丁标准品0.0200 g，置50mL量瓶中，加70 %的乙醇溶液，超声处理（功率：200W，频率：20kHz），振摇溶解，然后配成浓度为4.0mg·mL-1的芦丁标准液M和0.4mg·mL-1的芦丁标准液N。

实验样品溶液：精密称取每个月份（3、4、5、6、7、8、9、10月份）的臭茉莉叶粉末（过4号药典筛）1g左右分别于50mL锥形瓶，每个锥形瓶均精密加入20mL的70%乙醇，在60℃条件下超声（200W，40kHz）30min，提取2次，抽滤，合并滤液，恒温水浴下蒸干，残存物用70%乙醇溶解，然后至50mL容量瓶定容，即一年内8个月份臭茉莉叶实验样品溶液。

溶液的显色：精密移取8个月份的臭茉莉叶实验样品溶液各1.0 mL，均加入5 %亚硝酸钠溶液0.5 mL，振摇均匀，静置6min后，加入10 %硝酸铝溶液0.5mL，摇匀后再静置6min，接着加入4%氢氧化钠溶液5mL，静置15min后，即为8个月份实验样品溶液显色结果。

检测波长的确定：精密量取实验样品溶液和芦丁标准液N各1mL，以70%乙醇溶液为空白对照组，显色后在400～700nm波长范围内进行扫描，两者共有的最大吸收波长即为检测波长。芦丁标准品溶液和臭茉莉叶实验样品溶液在508nm处均为最大吸收波长，故确定508nm为实验检测波长。

2.2 标准曲线的绘制

精密量取芦丁标准品B 0.0，0.1，0.2，0.5，1.0mL，芦丁标准液M0.2，0.4mL，分别置于15mL具塞试管中，静置6min，用0mL试管做空白对照组，用紫外分光光度计，选择在508nm波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，以标准品溶液浓度为横坐标（mg·mL-1），绘制标准曲线。得到线性回归方程：A=1.7983C-0.02129（r=0.99934），结果表明，芦丁对照品质量浓度在0.04～1.60mg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.3 臭茉莉叶总黄酮提取率的计算

精密吸取臭茉莉叶实验样品溶液1.0mL，显色完成后，即刻测定其吸光度，由标准曲线所得的回归方程计算出实验样品溶液中总黄酮含量，以便计算出臭茉莉叶中总黄酮的提取率。

总黄酮提取率=实验样品液中总黄酮含量/臭茉莉叶质量×100%。

2.4 单因素实验

乙醇浓度对臭茉莉叶总黄酮提取的影响。固定料液比为1∶20（g·mL-1），温度为30℃，然后选择不同的乙醇浓度50%、60%、70%、80%、90%等条件下提取3次，每次30min，比较总黄酮含量，预测正交试验将要采用乙醇提取浓度范围。结果随着乙醇浓度增加后，臭茉莉叶总黄酮的提取率呈现出先升高后降低的变化趋势，在乙醇浓度为60%时，总黄酮提取率达到最高。见图1-A。

超声时间对臭茉莉叶总黄酮提取的影响。固定70%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶20g·mL-1，温度为30℃，选择不同的超声时间为25min、30min、35min、40min、45min等条件下提取3次，比较总黄酮含量，预测正交试验将采用的超声时间范围。结果显示随着超声提取时间的延长，臭茉莉叶总黄酮的提取率呈现先升高后降低的变化趋势，其中在超声提取时间为50 min时，总黄酮提取率达到最高。见图1-B。

料液比对臭茉莉叶总黄酮提取的影响。固定70 %乙醇为提取溶剂，温度为30 ℃，时间为每次30min，选择不同的料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g·mL-1）等条件下提取3次，测定比较总黄酮含量，预测正交试验将要采用的料液比范围。结果显示随着料液比提高，臭茉莉叶总黄酮的提取率呈现先升高后降低的变化趋势，其中在料液比为1∶25（g·mL-1）时，臭茉莉叶总黄酮提取率达到最高。见图1-C。

提取温度对臭茉莉叶总黄酮提取的影响。固定70%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶20g·mL-1，时间为30min，在不同的提取温度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃等条件下分别提取3次，测定比较总黄酮含量，预测正交试验将采用的提取温度范围。结果显示随着温度增高，臭茉莉叶总黄酮的提取率呈现先升高后降低的变化趋势，在温度为50 ℃时臭茉莉叶总黄酮提取率最高。见图1-D。

图1 乙醇浓度（A）、超声时间（B）、料液比（C）及提取温度（D）对臭茉莉总黄酮提取的影响

2.5 正交试验设计优选臭茉莉叶总黄酮提取最优工艺

综合前面单因素实验结果，在此基础上设计L9（34）正交实验，进一步研究乙醇浓度（A）、超声时间（B）、料液比（C）、提取温度（D）对臭茉莉叶总黄酮提取率的影响，正交试验因素与水平见表1，正交实验设计及结果见表2。

表1 L9（34）正交实验因素与水平表

表2 L9（34）正交实验结果

由表2可知，对臭茉莉叶总黄酮提取率的影响，由大到小排列依次是乙醇浓度＞料液比＞超声时间＞提取温度。总黄酮最佳提取工艺组合是A2B3C2D2，即乙醇浓度为60%，超声提取时间为60min，料液比为1∶25（g·mL-1），提取温度为50℃，按这个工艺提取的臭茉莉叶总黄酮含量最高。

2.6 臭茉莉叶总黄酮最优提取工艺稳定性试验

精确称定臭茉莉叶粉末1.0000g，按照最优提取工艺流程进行操作提取，显色完成后，立即测定溶液吸光度，然后，每间隔30min测一次溶液吸光度，考察4h内总黄酮的稳定性。结果臭茉莉叶总黄酮吸光度结果的RSD（n=9）值为0.95%，说明在4h内，黄酮标准品和臭茉莉叶总黄酮采用本文的提取方法和显色方法都比较稳定。

2.7 臭茉莉叶总黄酮最优提取工艺验证性实验

准确称取臭茉莉叶粉末10.0000g，3份，按照最优提取工艺进行提取操作，显色完成后，立即测定溶液吸光度，计算臭茉莉叶总黄酮平均提取率和含量。结果臭茉莉叶总黄酮平均提取率为5.18%，RSD=2.17%（n=3）。臭茉莉叶总黄酮含量为5.18mg·g-1。与正交试验结果基本一致，表明最优工艺合理可行。

2.8 臭茉莉叶总黄酮最优提取精密度实验

精密吸取芦丁对照品溶液1 mL，置于15 mL具塞试管中，按“2.1”方法显色并制备空白溶液后在508nm波长处测定吸光度，平行操作5次。结果，RSD＝0.27%（n=5），表明仪器精密度良好。

2.9 臭茉莉叶3-10月份总黄酮含量测定结果

采用正交实验优选的最优工艺条件，提取测定臭茉莉3～10等8个月份总黄酮，从图E可以看出，臭茉莉总黄酮代谢变化呈现出“高-低-高-低-高-低”的趋势。3月份总黄酮含量最高，总黄酮/药材量达0.0235mg·g-1，也就是臭茉莉刚刚长出嫩芽时就总黄酮含量最高；其次是5月的0.0194 mg·g-1和7月的0.0182 mg·g-1，3月份总黄酮含量最高，出现这种情况的可能原因是经历了一个冬天的休眠，春季刚开始进行旺盛的生命活动，代谢转化产生了黄酮，尽管总黄酮含量最高，但刚发的芽叶片比较小，经济产量还是比较低；5月份和7月份总黄酮含量比较高，此时枝繁叶茂，叶片经济产量比较高，适合采收；到了8～10月，植物叶片产量增加不大，黄酮含量减少，经济产量比较低，经济效益就低。黄酮属于植物新陈代谢的次生产物，总黄酮含量变化符合植物生长大周期规律。

图E 臭茉莉叶3-10月份总黄酮含量变化趋势

3 讨 论

提取工艺简单可行。通过单因素实验和正交实验，优选出提取总黄酮的最优工艺，即乙醇浓度为70%，超声时间为60min，料液比为1∶25（g·mL-1），提取温度为50℃，提高臭茉莉叶总黄酮提取率。4个因素对臭茉莉叶总黄酮提取率影响的大小一次是提取溶剂浓度＞料液比＞超声时间＞提取温度，因此提取过程中一定要严格把控提取溶剂浓度，它对总黄酮的提取率有显著影响，在一定范围内，臭茉莉叶总黄酮提取率会随着溶剂浓度升高而增大。

总黄酮含量呈周期变化。臭茉莉叶总黄酮一年内月周期变化基本符合植物叶片生长大周期规律，与植物生长代谢基本一致，当叶片生长快时，总黄酮含量低；当叶片生长慢时，总黄酮含量高；植物叶片不生长时，总黄酮含量下降［10］。

经济效益使用价值最高时采收。从总黄酮含量，尽管3月份含量最高，但是叶片产量最低，总黄酮使用价值仅从体外抗氧化活性分析［11］，臭茉莉叶总黄酮对DPPH自由基清除率6月份达最高，总黄酮对ABTS自由基的清除能力5月份和7月份出现两个峰值，所以，结合叶片产量、总黄酮含量和体外抗氧化效应等综合因素来考虑，5月份和7月份作为采收最佳时节。