李诗卉 邓静 粟倩 梁诗瑶 伊美瑾 林丽美 孙维广

〔摘要〕 目的 表征夏枯草果实石油醚提取物化学成分，评价其抗炎活性。方法 采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）对夏枯草果实的化学成分进行分析。建立RAW264.7细胞炎症模型，评价其抗炎效果。结果 共鉴定夏枯草果实石油醚提取物中19个化学成分。抗炎活性发现，夏枯草果实石油醚提取物均具有明显的抗炎效果。结论 夏枯草果实石油醚提取物成分及抗炎活性均具一定差异性。

〔关键词〕 夏枯草果实;石油醚提取物;气相色谱-质谱联用;抗炎

〔中图分类号〕R284.1;R285.5       〔文獻标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.06.009

〔Abstract〕 Objective To characterize the chemical constituents of petroleum ether extract from prunella vulgaris L. fruit， and to evaluate its anti-inflammatory activity. Methods GC-MS was used to detect the chemical constituents of the fruits of prunella vulgaris L. The RAW264.7 cell inflammation model was established， and its anti-inflammatory effect was evaluated. Results A total of 19 chemical compounds were identified from Prunella vulgaris L. The research on anti-inflammatory activity found that the petroleum ether extracts of Prunella vulgaris L. had significant anti-inflammatory effects. Conclusion The costituents and anti-inflammatory activities of the petroleum ether extracts of Prunella vulgaris L. have certain differences.

〔Keywords〕 fruit of Prunella vulgaris L.; petroleum ether extract; GC-MS; anti-inflammatory

夏枯草（Prunella vulgaris L.）为唇形科夏枯草属多年生草本植物，药用部位为干燥果穗，具有清火、明目、散结等功效，其主要化学成分有挥发油类、多糖类、黄酮类、三萜类等[1-2]。夏枯草为药食两用大宗中药材之一，是中成药夏枯草膏、夏桑菊颗粒等最为重要的原料药材，也是王老吉、夏桑菊饮料等凉茶的主要原料药材，市场需求极大。药用部位夏枯草果穗在入药前，通常堆放在仓库储存，一段时间后果穗中的部分果实散落于地。待果穗入药之后，通常会将散落地面的果实与尘土一起当成垃圾丢弃，造成资源的严重浪费。夏枯草果实是夏枯草果穗药用部位的组成之一，夏枯草果穗的活性成分在果实部位中也有大量分布[3]。因此，本文选择夏枯草果实为研究对象，首先进行其石油醚部位的提取，对提取部位采用GC-MS进行成分表征，采用体外炎症模型对该提取部位进行活性评价，报道如下。

1 材料

1.1  原料

夏枯草采购于湖南长沙高桥药材市场，经湖南中医药大学刘塔斯教授鉴定为唇形科夏枯草属植物夏枯草Prunella vulgaris L.，取干燥夏枯草果实部分;小鼠巨噬细胞RAW 264.7来自中国科学院上海细胞库。

1.2  主要试剂

无水乙醇、石油醚、甲醇、正己烷（国药集团化学试剂有限公司）;浓硫酸（株洲市星空化玻试剂有限公司）;胎牛血清、DMEM高糖培养基、双抗（链霉素、青霉素）、PBS磷酸缓冲液、胰蛋白酶（Hyclone公司）;噻唑蓝、脂多糖、二甲基亚砜（Sigma公司）;细胞冻存液（NCM bioech）;小鼠TNF-α ELISA 试剂盒、小鼠IL-6 ELISA 试剂盒（联科生物科技有限公司）;NO Griess 试剂盒（碧云天生物技术研究所）。

1.3  主要仪器

分析电子天平（奥多利斯科学仪器公司）;旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）;超纯水机（苏州赛恩斯仪器公司）;高速离心机（德国Eppendorf公司）;气相色谱-质谱联用仪（GC-MS，日本岛津）;多功能酶标仪（Thermo公司）;荧光生物显微镜（日本OLYMUS）;单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）;漩涡混轩逸（上海沪西分析仪器厂）;全自动细胞计数仪（美国Bio-Rad）。

2 方法

2.1  夏枯草果实石油醚提取物GC-MS指纹图谱

2.1.1  石油醚提取物的提取  剥开夏枯草果穗取其干燥果实，粉碎后过60目筛。取干燥药材粉末50 g，置于500 mL圆底烧瓶中，加入石油醚（b.p.60～90 ℃）300 mL浸泡1 h，加热回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩至油状，所得石油醚提取物加入无水乙醇萃取，冷藏过夜分层，取上层液减压浓缩除去乙醇，无水硫酸钠干燥即得石油醚提取物[4]。

2.1.2  甲酯化前处理  10 mg石油醚提取物加

400 μL 1%硫酸-甲醇溶液，于70 ℃水浴锅加热30 min，加400 μL 正己烷和1 mL蒸馏水，混匀，静置分层，取上清液进行GC-MS检测[5]。

2.1.3  GC-MS分析条件  色谱柱：DB-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;进样量1 μL;柱温：起始温度80 ℃保持2 min，以20 ℃/min的速度升温至160 ℃，再以8 ℃/min升温至270 ℃，保持10 min。载气：高纯氦气（99.999%）;流速1.0 mL/min;分流进样，分流比10∶1;进样口温度280 ℃;电子轰击离子源温度200 ℃;溶剂延迟时间6.5 min;质谱扫描范围m/z 35～550[6]。

2.2  抗炎能力测定

2.2.1  MTT法检测细胞毒性  取对数生长期细胞，以每孔5×103个种于96孔板，每组设置6个复孔，于37 ℃、5% CO2培养箱孵育24 h。分为正常组、模型组、药物组（浓度梯度为100.00、50.00、25.00、12.50、 6.25 μg/mL）。正常组与模型组加入100 μL细胞培养基，药物组每孔给药100 μL，药物组的每个浓度设置6个复孔，给药2 h后药物组与模型组加入100 μL 0.1 μg/mL的脂多糖，孵育24 h后每孔加入噻唑蓝，4 h后每孔加入150 μL二甲基亚砜摇床避光低速振荡15 min。酶联免疫检测仪于490 nm测量吸光值A，计算细胞存活率[7-8]。

2.2.2  炎症因子含量检测  各组细胞上清液经300×g离心10 min，收集上清。按照ELISA与Griess试剂盒说明书对IL-6、TNF-α及NO含量进行测定[9-11]。

3 结果

3.1  GC-MS测定结果

3.1.1  提取率  根据“2.1.1”石油醚提取物的提取方法得到夏枯草果实石油醚提取物，夏枯草果实得到石油醚提取物3.0 g，其提取率为6.0%。

3.1.2  成分分析  对夏枯草果实石油醚提取物GC-MS数据分析，得到夏枯草果实石油醚提取物主要成分为脂肪酸，共鉴定出19种化学成分，分别为2-十二烯基-1-琥珀酸酐、壬醛二甲基缩醛、肉豆蔻酸、9-十六烯酸、十六烷酸、亚麻酸、硬脂酸、亚油酸乙酯、11，13-二十碳二烯酸、顺11-二十烯酸、十八甲基癸酸、13-二十二碳烯酸、二十二烷酸、15-十四烯酸、二十四烷酸、角鲨烯、4，4，6a，6b，8a，11，11，14b-Octamethyl-1，4，4a，5，6，6a，6b，7，8，8a，9，10，11，12，12a，14，14a，14b-octadecahydro-2H-picen-3-one、己二酸、β-生育酚。见表1和图1。

3.2  抗炎能力测定结果

3.2.1  药物浓度筛选  取不同浓度（100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 μg/mL）夏枯草果实石油醚提取物刺激小鼠巨噬细胞，实验结果显示药物浓度小于25 μg/mL时基本无细胞毒性，即小于25.00 μg/mL为药物的最佳浓度范围。见图2。

3.2.2  药物对LPS诱导RAW264.7细胞分泌IL-6、TNF-α及NO的影响  在药物的最佳浓度范围选择3个浓度，即25.00、12.50、6.25 μg/mL，收集3个浓度上清液进行炎性因子检测。由图3可知，模型组细胞培养液中IL-6、TNF-α含量与正常组具有非常显著性差异（P<0.01），NO含量与正常组具有显著性差异（P<0.05）。将样品与模型组进行比较，药物组与模型组在3个炎性因子表达比较中大多具非常显著性差异（P<0.01），说明夏枯草果实石油醚提取物可显著抑制由LPS诱导RAW264.7细胞分泌的IL-6、TNF-α及NO炎性因子。见图3。

4 讨论

夏枯草以果穗入药前需晒干，在晒干过程中，大量果实散落于地上，通常这些果实与尘土一起当成垃圾丢弃，造成资源浪费。有研究[3]表明夏枯草果实的抗氧化活性比果穗高，为了进一步利用夏枯草药用部位资源，对夏枯草果实进行成分表征和活性评价显得尤为重要。本研究以夏枯草果实石油醚提取物为研究对象，对其化学成分进行表征，且进行抗炎活性研究。夏枯草果实得到石油醚提取物3.0 g，石油醚提取物提取率为6.0%。通过GC-MS检测，得到夏枯草果实石油醚提取物主要成分为脂肪酸，共鉴定出19种化学成分，分别为2-十二烯基-1-琥珀酸酐、壬醛二甲基缩醛、肉豆蔻酸、9-十六烯酸、十六烷酸、亚麻酸、硬脂酸、亚油酸乙酯、11，13-二十碳二烯酸、顺11-二十烯酸、十八甲基癸酸、13-二十二碳烯酸、二十二烷酸、15-十四烯酸、二十四烷酸、角鲨烯、4，4，6a，6b，8a，11，11，14b-Octamethyl-1，4，4a，5，6，6a，6b，7，8，8a，9，10，11，12，12a，14，14a，14b-octadecahydro-2H-picen-3-one、己二酸、β-生育酚。采用LPS诱导RAW264.7细胞建立炎癥模型，检测夏枯草果实石油醚提取物的抗炎效果，夏枯草果实石油醚提取物能显著抑制由LPS诱导RAW264.7细胞分泌的IL-6、TNF-α及NO炎性因子，具有较好的抗炎效果。

由于实验收集的夏枯草样本有限，且还存在不同年限、存储时间等的影响，因此，课题组拟进一步扩大样本量，采用体内外炎症模型结合谱效相关性，探索和验证夏枯草果实石油醚提取物得率、成分及活性，以期为夏枯草果实的进一步开发提供依据。

参考文献

[1] RAAFAT K， WURGLICS M， SCHUBERT-ZSILAVECZ M. Prunella vulgaris L. active components and their hypoglycemic and antinociceptive effects in alloxan-induced diabetic mice[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 2016， 84： 1008-1018.

[2] QU Z， ZHANG J， YANG H， et al. Prunella vulgaris L.， an edible and medicinal plant， attenuates scopolamine-induced memory impairment in rats[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2016， 65（2）： 291-300.

[3] 冯伟红，李  春，信伟梅，等.生物测定法用于中药质量评价的探索研究——以夏枯草抗氧化活性与总酚酸含量相关性的研究为例[J]. 中国中药杂志，2016，41（14）：2660-2668.

[4] 白发平，胡  静，吉  敬，等.水蒸气蒸馏联合顶空进样气质联用分析夏枯草挥发油成分[J].环球中医药，2019，12（2）：182-185.

[5] 陳新焕，张  莹，李拥军，等.GC-MS法分析植物油酸中的脂肪酸[J].分析科学学报，2001，17（5）：438.

[6] 雷思敏.夏枯草果实的成分分析及其抗炎抗氧化活性研究[D].长沙：湖南中医药大学，2019.

[7] KWON O K， LEE M Y， YUK J E， et al. Anti-inflammatory effects of methanol extracts of the root of Lilium lancifolium on LPS-stimulated Raw264.7 cells[J]. Journal of Ethnopharmacology， 130（1）： 28-34.

[8] XU J， ZHAO Y， AISA H A. Anti-inflammatory effect of pomegranate flower in lipopolysaccharide （LPS）-stimulated RAW264.7 macroph-ages[J]. Pharmaceutical Biology， 55（1）： 2095-2101.

[9] WEI H， HU S， SU Z， et al. Myricetin attenuates LPS-induced Inflammation in RAW 264.7 macrophages and mouse models[J]. Future Medicinal Chemistry， 2018， 10（19）： 2253-2264.

[10] KANG N， CHANG K J， PARK S Y， et al. Anti-inflammatory Effects of Galactose-Taurine Sodium Salt in LPS-Activated RAW 264.7 Cells[J]. Advances in Experimental Medicine & Biology， 2017： 943-953.

[11] LI G， WANG J， JIN M， et al. A new pentacyclic triterpenoid from the leaves of Rhododendron dauricum L. with inhibition of NO production in LPS-induced RAW 264.7 cells[J]. Natural Product Research， 2019： 1-7.