慢性心衰心气阴虚证模型大鼠的粪便代谢组学研究

2020-07-18钟森杰李静黄淑敏杨梦邱宏程彬胡志希李琳

湖南中医药大学学报 2020年6期

钟森杰李静黄淑敏杨梦邱宏程彬胡志希李琳

〔摘要〕目的研究慢性心衰心气阴虚证大鼠的粪便代谢组学特征。方法 13只Dahl盐敏感大鼠随机分为空白对照组（6只）和模型组（7只），以高盐饲料（8%NaCl）饲养模型组大鼠20周复制心衰模型。成模后采集两组大鼠的粪便样本，运用超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）联用技术和多元统计分析其代谢成分。结果主成分分析和偏最小二乘判别分析得到的得分图显示，两组的代谢成分积分点完全分离，表明两组大鼠的代谢模式存在明显差异。与空白对照组比较，模型组神经氨酸、尿苷、丙氨酰色氨酸、酪氨酰缬氨酸、苯丙氨酰甘氨酸、牛磺脱氧胆酸、粪甾烷酸、白三烯E4的水平上调，谷氨酸、酪氨酸、烟酸、鞘氨醇、二十四烷酸、二十二碳六烯酸、亚油酸的水平下调。15种差异代谢产物参与了19条代谢通路，其中氮代谢通路和氨酰tRNA的生物合成通路富集性较显著。结论慢性心衰心氣阴虚证大鼠的代谢功能异常，其病理机制涉及氨基酸代谢紊乱、蛋白质代谢紊乱、脂代谢紊乱、炎症反应、肠道功能失衡等多个层面。

〔关键词〕慢性心衰;心气阴虚证;代谢组学

〔中图分类号〕R285.5;R541.6+;969.1 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.06.004

〔Abstract〕 Objective To study the fecal metabolomic characteristics of rats with heart-Qi Yin deficiency syndrome of chronic heart failure. Methods Thirteen Dahl salt-sensitive rats were divided into a blank control group （6 rats） and a model group （7 rats）. Rats in the model group were fed with high salt diet （8% NaCl） for 20 weeks to replicate the heart failure model. After modeling， fecal samples from the 2 groups of rats were collected， and their metabolic components were analyzed using ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry （UPLC-MS） combined technology and multivariate statistical analysis. Results The score chart obtained by principal component analysis and partial least squares-discriminant analysis showed that the integral point of metabolic components was completely separated between the 2 groups， indicating that there was a significant difference in metabolic pattern between the 2 groups. Compared with the blank control group， the levels of neuraminic acid， uridine， alanyl tryptophan， tyrosinyl valine， phenylalanyl glycine， taurodeoxycholic acid， coprocholic acid and leukotriene E4 in the model group were up-regulated. The levels of glutamic acid， tyrosine， nicotinic acid， sphingosine， tetracarboxylic acid，docosahexaenoic acid and linoleic acid were down-regulated. 15 different metabolites participated in 19 metabolic pathways. Nitrogen metabolism pathway and aminoacyl-tRNA biosynthesis pathway had more significant enrichment. Conclusion Metabolic function of rats with heart-Qi Yin deficiency syndrome of chronic heart failure was disturbed. Its pathological mechanism involves amino acid metabolism disorder， protein metabolism disorder， lipid metabolism disorder， inflammatory reaction， intestinal dysfunction and other aspects.

〔Keywords〕 chronic heart failure; heart-Qi Yin deficiency syndrome; metabolomics

前期研究基于“以方测证”法及一般行为观察，验证高血压心衰大鼠模型属心气阴虚证，构建了可靠的病证结合动物模型，并从血浆代谢组学角度对该模型的生物学基础进行初探[1-3]。随着生物信息学研究的深入，已有多项研究发现，肠道微生物及其代谢产物与高血压病、慢性心衰等心血管疾病的发生发展存在密切关联[4]。本研究运用基于超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）联用技术观察粪便中代谢产物及相关代谢途径的变化，以期多层次、多角度阐释该病证模型的病理机制及生物学基础，为今后开展心衰的靶向代谢组学及肠道菌群研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

6周龄Dahl盐敏感大鼠13只，体质量（230±10） g，北京维通利华实验动物有限公司提供，动物合格证号：43004700037714，饲养于湖南中医药大学SPF级实验室内。所有大鼠予常规饲料（0.3%NaCl浓度）适应性培育至7周龄，以随机数字表法分为空白对照组（6只）和模型组（7只）。

1.2 主要仪器与试剂

主要仪器：JXFSTPRP-24/32型研磨器（上海净信实业发展有限公司）;TGL-16MS型台式冷冻离心机（上海卢湘仪仪器有限公司）;ACQUITY UPLC型高效液相色谱仪、Xevo G2-XS QTof型质谱仪（Waters科技有限公司）;BP-2010A型实验动物血压计（北京Softron有限公司）;SB-5200DT型超声清洗器（宁波新芝科技有限公司）;SonoScape-S2N型实验动物超声仪（深圳开立科技有限公司）。

主要试剂：L-2-氯苯丙氨酸（上海恒創生物科技公司）;甲醇、甲酸、乙腈（上海安谱实验科技公司）;所有试剂皆为分析纯、色谱级。

1.3 模型制备

模型的制备与验证均依据本课题组的前期研究结果[1-2]。空白对照组予常规饲料饲养，模型组予高盐（8%NaCl）饲料饲养，每只每天20 g饲料，自由取水，共饲养20周。每日观察一般行为及体征情况，每两周检测1次鼠尾血压，饲养20周后行心脏超声检测和血清氨基末端脑钠肽前体（N-Terminal-pro brain natriuretic peptide， NT-proBNP）含量测量，以评价模型是否建立成功。

1.4 粪便样本预处理

模型建立成功后，收集所有大鼠的粪便样本，进行上机前的预处理：（1）60 mg粪样中添加20 μL的L-2-氯苯丙氨酸（0.3 mg/mL）和600 μL的甲醇∶水（V∶V=4∶1）;（2）添加两颗钢珠，-20 ℃预冷2 min，研磨机60 Hz条件下研磨2 min;（3）超声提取10 min，低温条件下放置30 min;（4）离心10 min（12 000 r/min、4 ℃），取200 μL上清液，过滤后装瓶，保存于-80 ℃冰箱中，待上机检测用。

1.5 UPLC-MS分析条件

色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱温45 ℃;流动相：A-水、B-乙腈，流速0.4 mL/min，进样量为5 μL。质谱条件：选用ESI离子源，在正、负离子模式下进行信号采集;Capillary voltages设置：正离子3 kv，负离子-2 kv。

1.6 数据处理

运用Progenesis QI v2.3软件处理上机检测后得到的原始数据，主要进行基线过滤、保留时间校正、峰对齐和峰识别。将正、负离子数据合并成一个数据矩阵，矩阵包含了原始数据提取到的所有可以用于后续分析的信息。基于精确质量数、二级碎片以及同位素分布，选用Human Metabolome Database数据库和Metlin数据库进行化合物的定性定量分析。

1.7 统计学分析

运用SIMCA14.0软件分析数据矩阵，先进行无监督的主成分分析（PCA），随后进行有监督的偏最小二乘判别分析（PLS-DA），生成得分图。差异代谢物筛选基于正交-偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），以变量权重值VIP>1.0视为对分类具有较大贡献的变量，进一步行t检验和Log2（FC）分析，以P<0.05且FC>2.0为最终纳入条件。运用MetaboAnalyst网络软件进行差异代谢物的通路拓扑分析，筛选出与模型相关的显著通路。

2 结果

2.1 模型评价

自高盐饮食后，模型组大鼠的收缩压一直维持在140 mmHg上，饲养4周后基本保持在160 mmHg以上，符合高血压病的诊断标准，可构成心脏器质性损伤;空白对照组大鼠的收缩压始终未超过140 mmHg，难以构成靶器官心脏的损伤，可作为空白对照。饲养结束后，模型组左心室射血分数（left ventricular ejection fraction， LVEF）、左室短轴缩短率（fraction shortening， FS）显著低于空白对照组（P<0.01），NT-proBNP值显著高于空白对照组（P<0.01），确定已成慢性心衰模型，见表1。

造模结束后，模型组大鼠均出现心率增快、精神萎靡、呼吸急促、蜷缩喜卧、易激怒等体征及行为表现，较好地表现出心悸、气短、乏力、烦躁等心气阴虚证的证候特点，符合本课题组前期“以方测证”研究的结果，认为已成心气阴虚证动物模型[1-3]。

2.2 总离子流图

UPLC-MS分析后，获得两组大鼠正负离子模式下的代表性总离子流图（total ion chromatography， TIC），具体见图1。

2.3 模式判别分析

PCA可从总体角度反映样本组间和组内的变异度，从PCA得分图中可直观地看出两组样本之间的整体代谢轮廓差异;PLS-DA运用偏最小二乘回归建立代谢物表达量与样本分组之间的关系模型，以预测样本类别，解释组间差异。从两组大鼠的PCA得分图、PLS-DA得分图（图2）可看出，两组的样本点在分布上完全分开，组内的聚集效果良好，组间的分离趋势显著，预测模型的拟合能力较好。表明慢性心衰心气阴虚证大鼠的代谢功能被明显扰动，与正常大鼠间存在显著的代谢表型差异。

2.4 差异代谢物筛选

OPLS-DA模型下的变量权重值（VIP）可以说明某一变量对造成分组的贡献;Log2（FC）值说明代谢物在两组样本中平均表达量的比值。本次研究对筛选VIP>1.0的慢性心衰心气阴虚证大鼠代谢物进行t检验及FC分析，以P<0.05且FC>2.0为条件，共挖掘出组间差异代谢物15种，具体见表2。与空白对照组比较，模型组神经氨酸、尿苷、丙氨酰色氨酸、酪氨酰缬氨酸、苯丙氨酰甘氨酸、牛磺脱氧胆酸、粪甾烷酸、白三烯E4的水平上调，谷氨酸、酪氨酸、烟酸、鞘氨醇、二十四烷酸、二十二碳六烯酸、亚油酸的水平下调。

2.5 代谢路径分析

为进一步解读代谢图谱，选用MetaboAnalyst网络软件（https：//www.metaboanalyst.ca/）进行差异代谢物的路径拓扑分析。分析发现，与模型大鼠相关的15种差异代谢产物共参与19条代谢通路，绘制了通路分析概要图，以全局性的角度观察模型的生物学变化，见图3。其中2条通路富集性较显著，分别为氮代谢通路（nitrogen metabolism）和氨酰tRNA的生物合成（aminoacyl-tRNA biosynthesis）。

3 讨论

在心衰的病理过程中，心脏的功能与结构持续受损，机体供能不足，这必然会引起体内部分功能的失衡。前期研究以血液代谢产物为切入点，发现慢性心衰心气阴虚证模型的内源性代谢功能被明显扰动，存在三大代谢途径（氨基酸、糖类、脂类）紊乱和肝功能损伤[3]。粪便代谢物是肠道微生物和宿主共代谢的结果，许多研究证据表明：肠道微生物及其代谢产物与心衰间有着广泛关联，这为开展心衰模型的粪便代谢组学研究提供了依据[5]。本研究发现慢性心衰心气阴虚证模型大鼠的粪便代谢轮廓出现变化，筛选出与该模型相关的15种代谢物和2条代谢路径，对上述关键信息进行分析，以进一步阐明该病证的微观本质。

在已筛选的差异代谢物中，氨基酸及其合成的多肽类物质占比最重。心衰的病理过程中伴随着心脏产能的底物利用改变，即糖、脂氧化供能向氨基酸供能转化，氨基酸代谢增强以满足机体的能量需求，故可见氨基酸类物质谷氨酸、酪氨酸的水平紊乱。谷氨酸、酪氨酸参与了氨酰tRNA的生物合成，氨酰tRNA的主要作用为转运氨基酸以促进蛋白质的合成[6]。氨基酸和氨酰tRNA出现改变，直接影响了蛋白质的合成，同时心衰时的各种损伤因素均可导致蛋白质代谢的异常，主要体现在丙氨酰色氨酸、酪氨酰缬氨酸和苯丙氨酰甘氨酸等蛋白质水解的中间产物呈高水平表达状态。

鞘氨醇属鞘脂类化合物，参与细胞的生长、分化、衰老和程序性死亡等重要的信号转导过程，是细胞膜结构的重要组成成分[7]。长期高盐饮食会损伤血管内皮细胞而诱发炎症反应，损伤血管构架与功能，推动高血压病、心衰等心血管疾病的发展进程。炎症反应可扰动细胞膜，影响鞘脂类代谢通路，同时产生白三烯E4等炎症介质类化合物[8]。另有研究表明，氮代谢通路异常可上调部分细胞因子及生物活性物质的表达，与炎症反应关系密切[9]。鞘氨醇、白三烯E4水平紊乱及氮代谢通路异常，验证了炎症反应是该病证模型的病理机制之一。

脂类代谢方面，二十二碳六烯酸和亚油酸均属于多不饱和脂肪酸，二十二碳六烯酸具有促进胆固醇排泄、抑制内源性胆固醇合成的作用;亚油酸能与胆固醇结合，防止胆固醇淤积于血管壁，从而调节体内脂质堆积[10]。不饱和脂肪酸在脂质调节方面发挥着重要的作用，其水平紊乱是导致体内脂类代谢障碍的关键原因之一。二十四烷酸是一种长链脂肪酸，多呈游离状态存在，有异于大部分脂肪酸，但目前针对该物质的研究较少，其变化机制有待进一步的研究。

牛磺脱氧胆酸属结合胆汁酸，由游离胆汁酸以酰胺键与牛磺酸相结合而生成;粪甾烷酸属三羟基胆汁酸。前期研究已证实该模型存在胆固醇代谢障碍，胆固醇直接参与胆汁酸的合成，其代谢障碍必然影响胆汁酸代谢，故可见牛磺脱氧胆酸和粪甾烷酸水平紊乱[11]。另一方面，胆汁酸主要存在于肠-肝循环系统中，可在肠道内转运脂肪，调节脂类代谢，从胆汁酸代谢障碍推测出该模型可能存在肠道功能的失衡[12]。值得注意的是，本研究发现的二十二碳六烯酸、亚油酸和烟酸等物质，主要来源于肠道对食物的摄取，生物体内的自身生成量甚少，上述物质的水平紊乱也在一定程度上反映了模型的肠道功能失衡。

综合分析慢性心衰心气阴虚证模型大鼠的粪便代谢图谱，发现该病证模型的病理机制涉及氨基酸、蛋白质、脂代谢紊乱和炎症反应、肠道功能失衡等多个层面。本研究进一步揭示了与该病证模型相关的生物学信息，以期为心衰的诊疗提供新思路，并为今后开展心衰模型的靶向代谢组学和肠道菌群研究提供借鉴。

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