张勇，张声源，黄思涵，林大都*

嘉应学院医学院（梅州 514031）

银桦（Grevillea robusta A. Cunn. ex R. Br.）为山龙眼科（Proteaceae）银桦属（Grevillea）常绿高大乔木，其叶子对有毒气体如二氧化硫、氟化氢和氯化氢等有较强抗性，是理想的城市绿化树种[1]。银桦为山龙眼科植物，存在多种类型的化学成分，医用价值较高；含有多种生物活性，在抗肿瘤、抗病毒和抗阿尔茨海默病等药物方面做出贡献[2]。中医认为，桦树液可祛痰止咳，清热解毒，主治咳嗽、气喘、小便赤涩；桦树皮内用可清热利湿解毒，外用治烧烫伤，痈疖肿毒。银桦果实中还含有具有镇静作用的豆腐果苷，可用于神经衰弱及血管神经性头痛等病症的治疗。不仅如此，银桦树中含有丰富的化学营养物质[3]，譬如各种氨基酸和微量元素，维生素等。Kallio等[4]对芬兰银桦树液进行一系列试验，试验结果表明此银桦树液无诱变性和毒性，作为绿色食品原料前景广阔。现代研究结果表明[5-8]，银桦中含有多种酚类物质，具有一定抗疟活性与抗癌活性。国内对银桦叶不同极性部位的抗氧化活性研究尚未见报道。因此，采用普鲁士蓝法、DPPH自由基清除法和ABTS自由基清除法对银桦叶甲醇提取物及其不同极性萃取部位的体外抗氧化能力进行评价，旨在为银桦叶的综合开发和有效利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药材与试剂

银桦叶（采自嘉应学院医学院杏林天然药物园）；DPPH（北京索莱宝科技有限公司）；ABTS（苏州郎行生物科技有限公司）；VC对照品（纯度≥98%）、十二水合磷酸氢二钠、过硫酸钾、二水合磷酸二氢钠、三氯乙酸（西陇科学股份有限公司）；其他试剂

[14] DONG W J, ZHAO J P, HU R S, et al. Differentiation of Chinese Robusta coffees according to species, using a combined electronic nose and tongue, with the aid of chemometrics[J].Food Chemistry, 2017, 229: 743-751.

[15] YU P, YEO A S, LOW M, et al. Identifying key nonvolatile compounds taste profile in ready-to-drink green tea and their impact on taste profile[J]. Food Chemistry, 2014,均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JP-100S超声波清洗机（深圳市杰蒙清洗设备有限公司）；AUW220D电子微量天平（日本岛津公司）；BT125D电子分析天平、D-16C离心机（德国Sartorius公司）；78-0070旋转蒸发仪（美国KD公司）；UV5紫外-可见分光光度计（瑞士METTLERTOLEDO公司）；DU-20电热恒温油浴锅（郑州南北仪器设备有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

采集1.5 kg新鲜银桦叶，预处理后剪碎，用3 000 mL甲醇超声（37 ℃，30 min）提取2次，合并提取液，减压浓缩得银桦叶甲醇提取物（总浸膏），代号为GR-T（68 g）。取50 g总浸膏，加水悬浮，移置1 000 mL分液漏斗中，依次用正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取，保留水层，减压浓缩后，得正丁醇萃取物、代号为GR-B（12 g），乙酸乙酯萃取物、代号为GR-E（13 g），石油醚萃取物、代号为GR-P（5 g），水提物、代号为GR-W（10 g），所有样品均冷藏备用。

1.3.2 体外抗氧化活性评价

1.3.2.1 还原能力的测定

参照杨阳等[9]的方法，并做适当改进。将2.5 mL不同质量浓度的样品溶液精确移取到10 mL试管中，并分别加入2.5 mL磷酸缓冲液（2.0 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，摇匀，50 ℃恒温水浴20 min，取出急速冷却，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液。将上述溶液离心10 min（6 000 r/min），取2.5 mL上清液，再加入2.0 mL蒸馏水及0.5 mL 0.1% FeCl3，混匀，静置10 min后于700 nm测定吸光度。将VC溶液用作阳性对照组，平行测定3次，获得平均值。

1.3.2.2 清除DPPH·能力测定

参照孙崇鲁等[10]的方法，并做适当改动。取100 μL不同质量浓度的样品溶液，分别将其加入3.9 mL 0.2 mmol/L DPPH无水乙醇溶液中，暗室反应30 min，以无水乙醇溶剂作空白对照，测定波长517 nm处的吸光度（Ai）；将3.9 mL 0.2 mmol·L-1DPPH无水乙醇溶液与100 μL无水乙醇混合后，测定波长517 nm处的吸光度（A0）；测定3.9 mL无水乙醇溶液与100 μL样品溶液在波长517 nm处的吸光度（Aj）。将VC溶液用作阳性对照组，平行测定上述试验3次，获得平均值。根据式（1）计算出样品和VC对DPPH·清除率。

1.3.2.3 清除ABTS+·能力测定

参照陈磊等[11]的方法，并做适当的修改。将100 μL不同质量浓度的样品溶液加入到3.9 mL ABTS+·溶液中并精确摇动30 s，室温静置10 min，测定波长734 nm处的吸光度（Ai）；测定3.9 mL ABTS+·溶液与100 μL无水乙醇混合后在波长734 nm处的吸光度（A0）；测定3.9 mL无水乙醇与100 μL样品溶液在波长734 nm处的吸光度（Aj）。将VC溶液用作阳性对照组，平行测定上述试验3次，获得平均值。根据式（2）计算出样品和VC对ABTS+·清除率。

2 结果与分析

2.1 还原能力测试结果

由图1和表1～表3可知，银桦叶不同溶剂提取物均表现出不同程度的还原能力，且还原能力在试验浓度范围内随溶液浓度的增加而增强，呈正相关性，但还原能力均小于VC。在相同质量浓度下，GR-E的铁还原力最强，其次是GR-T。各提取物还原能力大小依次为：VC＞GR-E＞GR-T＞GR-B＞GR-W＞GR-P。

图1 银桦叶各溶剂提取物还原能力

表1 VC对铁还原力的测定结果

表2 银桦叶各溶剂提取物对铁还原力的测定结果

表3 银桦叶各溶剂提取物对铁还原吸光度的回归分析

2.2 清除DPPH·的测试结果

由图2、表4和表5可知，在一定质量浓度范围内，银桦叶各溶剂提取物对DPPH·均有良好清除作用，随着试验质量浓度增大，测得的吸光度减小，其对DPPH·清除作用逐渐增强。由表6可知，GR-T、GR-E清除DPPH·作用较强，IC50值分别为0.025 7和0.026 4 mg/mL，根据IC50值评价测定，IC50值越小，表示清除DPPH·能力越好。各提取物清除DPPH·能力强弱依次为：VC＞GR-T＞GR-E＞GR-B＞GR-W＞GR-P。

图2 银桦叶各溶剂提取物对DPPH·的清除能力

表4 VC对DPPH·清除率的测定结果

表5 银桦叶各溶剂提取物对DPPH·清除率的测定结果

表6 银桦叶各溶剂提取物对DPPH·清除率的回归分析

2.3 清除ABTS+·的测试结果

由图3、表7和表8可知，银桦叶各溶剂提取物对ABTS+具有一定清除能力，质量浓度为0.2 mg/mL时，GR-T对ABTS+·清除率达59.17%，GR-W清除率最低，仅17.42%，各提取物清除ABTS+·能力强弱依次为：VC＞GR-T＞GR-E＞GR-B＞GR-P＞GR-W。由表9相关性分析可知，GR-T、GR-E、GR-B、GR-P、GR-W的质量浓度与清除率的相关系数（R2）分别为0.983 97，0.993 57，0.961 02，0.968 85和0.963 45，表明各提取物清除ABTS+·能力与质量浓度之间有良好相关性，且各提取物IC50均小于1 mg/mL，具有良好的抗氧化活性。

图3 银桦叶各溶剂提取物对ABTS+·清除能力

表7 VC对ABTS+清除率的测定结果

表8 银桦叶各溶剂提取物对ABTS+·清除率的测定结果

表9 银桦叶各溶剂提取物对ABTS+·清除率的回归分析

3 讨论

医学研究证实，许多慢性疾病，包括心血管、消化、内分泌和呼吸，都与人体内积聚的过多自由基有关。研究表明，黄酮类、酚类、皂苷、多糖等多类中药化学成分具有良好的抗氧化活性[12-13]，从天然药物中寻找抗氧化剂来清除人体内的自由基将成为医药研发行业发展的潮流和趋势。

采用普鲁士蓝法、DPPH自由基清除法和ABTS自由基清除法对银桦叶不同溶剂提取物的抗氧化能力进行评价。结果表明，银桦叶不同溶剂提取物均表现出不同程度的还原力和清除作用，并呈明显的量效关系。其中，甲醇提取物、乙酸乙酯萃取物对铁还原力和清除DPPH·、ABTS+·作用最强，提示银桦叶抗氧化活性成分主要集中在醇提部位和乙酸乙酯部位，可作为探究银桦叶抗氧化活性的主要极性部位进行深入研究。银桦在中国广泛分布，资源丰富，从中筛选抗氧活性较强萃取物，为银桦叶抗氧化活性成分的提取分离及其天然抗氧化剂的开发利用提供研究的试验数据，为银桦叶在食品、药品和保健品等领域的深入开发提供理论参考。

4 结论

在一定浓度范围内，银桦叶不同溶剂提取物的清除能力与样品浓度呈良好的量效关系，其中甲醇提取物和乙酸乙酯萃取物抗氧化活性最强。