张 勇，宋亚芬，陈 玲，张 兵，张 敏，王静文，杨承槐，蒋桃珍

(中国兽医药品监察所，北京100081)

猪流感(Swine influenza, SI)是由猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)引起的猪的一种急性、呼吸系统传染性疾病。该病一般发病率较高，死亡率低，呈世界分布，但主要以地方流行为主。猪流感一年四季均可发生，但以春秋两季多发，可在不同日龄、品种和性别的猪群中暴发[1-3]。感染SIV的猪群，其生产性能及对其他疾病的抵抗能力均会降低，进而可对养猪业造成重大损失。A型流感病毒的基因组由8个分节段的RNA组成，当两个不同来源的流感病毒同时感染同一宿主时，病毒在复制过程中就有可能在细胞内产生基因重配[4]。猪呼吸道上皮细胞表面同时具有人和禽流感病毒两种类型的受体，人和禽流感病毒都可以感染猪，新型流感病毒往往是在猪体内通过基因重组而产生，因此，猪被认为是禽、人流感病毒的中间宿主和基因“混合器”[5-6]。目前，世界各地流行的SIV主要是H1N1、H1N2和H3N2亚型流感病毒[7-9]。此外，H1N7、H3N1、H3N6、H4N6、H5N1、H9N2等亚型的流感病毒也可在猪群中偶尔分离得到，但目前没有证据显示这些病毒在猪体内建立稳定的谱系[10-12]。本研究对广州规模化养猪场疑似流感的病料中分离鉴定的2株SIV全基因组的分子特征进行了系统分析，可为我国猪流感的预防和控制提供一定的支撑性数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料、鸡胚 2株H3N2亚型猪流感病毒 A/swine/Guangdong/1519/2012(H3N2)(简称GD1519)和A/swine/Guangdong/1520/2012(H3N2)(简称GD1520)于2012年分离自广东某猪场具有流感样症状的猪的肺脏，现由中国兽医微生物菌种保藏管理中心保存。9～10日龄SPF鸡胚购自北京勃琳格殷格翰维通生物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂 pMD19-T克隆载体、E.coliDH5α Competent Cells、ExTaq酶、RNA酶抑制剂，均购自宝生物工程(大连)有限公司；TRIZOL LS Reagent试剂购自Invitrogen公司；MLV反转录酶购自Promega公司；DNA纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒，购自天根生化科技有限公司；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 引物合成 用DNA Star 7.1及Oligo 7.0软件设计扩增病毒8个基因片段的相关引物后，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成(表1)。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取和cDNA的获得 取250 μL含有病毒的鸡胚尿囊液，加入750 μL TRIZOL LS Reagent，按照TRIZOL LS Reagent试剂盒说明书提取病毒总RNA。将获得的病毒总RNA按MLV反转录试剂盒说明书，利用流感病毒反转录通用引物Uni-12(5’-AGCAAAAGCAGG-3’)进行反转录获得病毒cDNA。

表1 研究中所用引物Tab 1 Primers were used in this study

1.2.2 病毒基因片段的克隆和鉴定 用设计合成的SIV 8基因片段扩增引物对两株病毒的cDNA进行PCR扩增、产物纯化、连接pMD19-T载体并转化后经菌液PCR鉴定阳性的菌液，用质粒小提试剂盒进行重组质粒的抽提，所得质粒送至英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序鉴定。

1.2.3 遗传进化分析 为进一步明确分离病毒的遗传演化特征，利用 DNAStar 7.1中的 SeqMan 程序对8基因片段序列拼接，应用 NCBI中Blast 检索同源性序列并下载相关序列，利用MEGA 4.0软件中的Neighbor-joining法(参数设置为1000 replications)结合下载序列与本研究序列绘制病毒8个基因片段的遗传进化树。

2 结果与分析

2.1 2株病毒全基因组序列同源性分析 将通过测序拼接所得的2株H3N2亚型猪流感病毒的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS 8个基因片段输入GenBank进行Blast比对。结果显示，GD1519毒株的HA基因与A/swine/Henan/1/2010(H3N2)同源性最高，同源率为99.8%；其NA、PB2和NP基因与北美毒株A/swine/Colorado/1/1977(H3N2)同源性最高，同源率分别为99.6%、99.8%和99.7%； 其PB1、PA、M和NS基因与A/swine/Hunan/01/2008(H3N2)同源性最高，同源率分别为100%、100%、99.9%和99.7%。GD1520毒株的HA基因与A/swine/Henan/1/2010(H3N2)同源性最高，同源率为99.8%；其PB2和NS基因均与A/swine/Guangdong/L5/2010(H3N2)同源性最高，同源率分别为99.8%和99.9%； 其NA、PB1和M基因分别与A/swine/Guangdong/Z5/2003(H3N2)、A/swine/Guangdong/165/06(H3N2)和A/swine/Guangdong/164/06(H3N2)同源性最高，同源率分别为99.9%、100%和99.9%；其PA和NP基因均与A/swine/Guangdong/04/2005(H3N2)同源性最高，同源率分别为100%和99.9%(表2)。

2.2 病毒的遗传进化分析 于NCBI网站下载相关序列，结合中国兽医微生物菌种保藏管理中心分离毒株GD1519和GD1520利用MEGA4.0软件绘制8个基因片段的遗传进化树。结果显示：H3N2亚型流感病毒各个基因片段均可划分为Recent human、European swine、Victoria 75-like/Early human、Earliest human、Avian五个分支，其中，Recent human 分支可详细划分为Moscow/99-like、Sydney/97-like、New York/99-like三个亚分支。研究结果发现，GD1519病毒的HA、PB2、PA和NP基因片段均来源于近期人源H3N2亚型流感病毒分支的Moscow/99-like亚分支；其NA和PB1基因片段来源于早期人源H3N2亚型流感病毒分支的Victoria/75-like亚分支；其M和NS基因片段来源于近期人源H3N2亚型流感病毒分支的New York/99-like亚分支。GD1520病毒的HA基因片段来源于近期人源H3N2亚型流感病毒分支的Moscow/99-like亚分支；其NA和PB1基因来源于近期人源H3N2亚型流感病毒分支的New York/99-like亚分支；其PB2、PA、NP、M和NS基因片段均来源于早期人源H3N2亚型流感病毒分支的Victoria/75-like亚分支(图1)。针对两株病毒各基因的来源，绘制GD1519毒株和GD1520毒株基因重配类型分析模式图，直观表现各个基因片段来源及其重配类型(图2)。

表2 GD1519和GD1520毒株各基因片段与GenBank中相似性最高的毒株Tab 2 The SIV strains in GenBank with highest nucleotide homology to the GD1519 and GD1520 viruses when analyzing each gene segment

2.3 病毒的分子特征 分析2株H3N2亚型猪流感病毒的HA基因序列发现，2株病毒的HA基因编码区均由1701个核苷酸组成，编码566个氨基酸。根据其核苷酸序列推导的氨基酸序列分析显示，2株病毒HA蛋白裂解位点附近的氨基酸序列均为PEKQT↓G，均不具备连续的碱性氨基酸，符合低致病性流感病毒的裂解位点处氨基酸序列的分子特征(图2)。

比较分析2株H3N2亚型猪流感病毒的HA1蛋白与人源、欧亚猪源、禽源H3N2亚型流感病毒代表毒株HA1蛋白的分子差异时发现，所有病毒在HA1蛋白上均存在4个保守的潜在糖基化位点，分别位于：22-NGT、38-NAT、165-NVT和285-NGS。由于氨基酸突变，与欧亚猪源、禽源H3N2亚型流感病毒代表毒株相比，2株病毒和人源H3N2亚型流感病毒在HA1蛋白上的133位(NGT)和246位(NST)多出2个潜在的糖基化位点。另外，2株病毒和多数代表毒株在HA1蛋白上的8位、63位、122位和126位也存在潜在的糖基化位点(图3)。

图1 GD1519毒株和GD1520毒株 (a) HA、(b) NA、(c) PB2、(d) PB1、(e) PA、(f) NP、(g) M、(h) NS 基因的分子遗传进化分析Fig 1 Phylogenetic analysis (a) HA, (b) NA, (c) PB2, (d) PB1, (e) PA, (f) NP, (g) M and (h) NS of the GD1519 and GD1520 viruses

图2 GD1519与GD1520的基因重配模式图(用彩条代表的两种新型H3N2病毒的八个基因片段， 从上至下依次是PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS。每种不同的颜色代表不同的来源)Fig 2 Putative genomic compositions of the GD1519 and GD1520 viruses(The eight gene segments of two viruses are represented by horizontal bars. From top to bottom, PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, and NS. Each different color represents a distinct origin)

受体结合位点分析显示，2株病毒与人源、欧亚猪源、禽源H3N2亚型流感病毒代表毒株在HA1蛋白的98位、134位、136位、153位、183位、195位和224位均为酪氨酸(Y)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、酪氨酸(Y)和精氨酸(R)(图3)，与欧亚猪源、禽源H3N2亚型流感病毒代表毒株相比，2株病毒与人源H3N2亚型流感病毒代表毒株在135位(G→T)、155位(Y/T→H)、190位(E→D)发生3处明显的突变。与其他代表毒株相比，2株病毒与近期人源H3N2亚型流感病毒分支的Moscow/99-like亚分支中的代表毒株在194位发生了V(缬氨酸)到L(亮氨酸)的突变。分析发现，不同分支代表毒株的137位受体结合位点处的氨基酸差异较大，本研究的2株病毒与近期人源H3N2亚型流感病毒分支的Sydney/99-like亚分支中的A/swine/Hong Kong/2429/98 A/swine/Hong Kong/2429/98在137位均为苯丙氨酸。HA1蛋白226～228位氨基酸是影响病毒结合宿主的关键位点，分析发现，最早期、早期人源H3N2亚型流感病毒以及欧亚源H3N2亚型流感病毒在这些关键位点的氨基酸为L-S-S，禽源H3N2亚型流感病毒在这些关键位点的氨基酸为Q-S-G或Q-P-G，近期人源H3N2亚型流感病毒在这些关键位点的氨基酸为I-S-S或V-S-S。尽管GD1519和GD1520病毒的HA基因在遗传进化分析时，其来源于近期人源H3N2亚型流感病毒，但由于2株病毒在226位发生亮氨酸(L)到苏氨酸(T)的突变，2株病毒在这些关键位点的氨基酸为T-S-S。

两株病毒的NA基因的编码区均由1410个核苷酸组成，共编码469个氨基酸。糖基化位点分析表明，GD1519病毒共有8个潜在的糖基化位点，分别位于61-NIT、70-NTT、86-NWS、146-NDT、200-NAT、234-NGT、313-NSS、402-NRS。与早期人流感病毒代表毒株A/Victoria/3/1975(H3N2)相比，由于GD1519病毒在313位发生了天冬氨酸(D)到天冬酰胺(N)的氨基酸突变，多出了一个潜在糖基化位点。GD1520病毒与近期人流感病毒代表毒株A/New York/183/1999(H3N2)相比，均有9个潜在的糖基化位点，分别位于61-NIT、70-NTT、86-NWS、93-NIT、146-NDT、200-NAT、234-NGT、329-NDS、402-NRS。神经氨酸酶上可能的耐药性位点E119、R152、H274、R292和N294位的氨基酸均未发生变异。

内部基因分析表明，两株病毒在PB2蛋白的627位均发生了谷氨酸到赖氨酸(E→K)的突变，701位氨基酸未发生变化，仍为天冬氨酸(D)；GD1519病毒在26位和31位分别发生了亮氨酸到苯丙氨酸(L→F)和丝氨酸到天冬酰胺(S→N)的氨基酸突变；27位、30位和34位氨基酸未发生变化。GD1520病毒在26位、27位、30位、31位和34位氨基酸均未发生变化。两株病毒的NS1蛋白均在42位发生了脯氨酸到丝氨酸(P→S)的氨基酸突变，94位氨基酸未发生变化。

GD1519毒株和GD1520毒株的NA基因的编码区均由1410个核苷酸组成，共编码469个氨基酸。糖基化位点分析表明，GD1519病毒共有8个潜在的糖基化位点，分别位于61-NIT、70-NTT、86-NWS、146-NDT、200-NAT、234-NGT、313-NSS、402-NRS。与早期人流感病毒代表毒株A/Victoria/3/1975(H3N2)相比， GD1519病毒在313位发生了天冬氨酸(D)到天冬酰胺(N)的氨基酸突变，多出了一个潜在糖基化位点。GD1520与近期人流感病毒代表毒株A/New York/183/1999(H3N2)一样，均有9个潜在的糖基化位点，分别位于61-NIT、70-NTT、86-NWS、93-NIT、146-NDT、200-NAT、234-NGT、329-NDS、402-NRS。其它内部基因分析表明，两株病毒在PB2蛋白的627位均发生了谷氨酸到赖氨酸(E→K)的突变；GD1519病毒在26位和31位分别发生了亮氨酸到苯丙氨酸(L→F)和丝氨酸到天冬酰胺(S→N)的氨基酸突变。

红色方框标记：糖基化位点；绿色方框标记：裂解位点；绿色五角星标记：受体结合位点；a、b、c代表：抗原位点Red boxes: potential glycosylation site; green box: cleavage site; green pentagram: receptor binding site; a, b, and c represent: antigen site图3 HA1蛋白氨基酸序列比对Fig 3 Molecular analysis of HA1 amino acid sequences of the GD1519 virus, GD1520 virus, and reference viruses

3 讨论与结论

猪流感病毒自1930年首次从猪体内分离[10]，不断发生进化，不仅对养猪业造成了重大损失，也对公共卫生安全造成了一定的威胁。猪作为甲型流感病毒生态学的重要宿主, 由于猪呼吸道受体的特异性，猪对人和禽流感病毒都易感，自然条件下，禽和人流感病毒可直接感染猪[11]，也有研究结果发现，SIV也可以感染禽和人[12]。本研究分离的两株病毒在遗传进化分析结果显示GD1519和GD1520的基因片段分别来源近期人源H3N2亚型Moscow/99-like亚分支、早期人源H3N2亚型Victoria/75-like亚分支、近期人源H3N2亚型New York/99-like亚分支。该结果暗示2株SIVs是由不同来源不同时期的类人源H3N2亚型流感病毒间基因重排而产生新型类人源H3N2亚型猪流感病毒。该研究结果进一步证实了猪是可以作为人流感病毒的贮存宿主，在流感病毒的进化和种间传播中具有重要的作用。

流感病毒的受体特异性与HA蛋白受体结合位点处的氨基酸密切相关[13]，对人H3N2流感病毒而言，HA L266位和S228位氨基酸的改变会影响病毒与SA-α2,6-Gal的受体结合特性。分析两株病毒的受体结合位点发现，本研究分离的两株病毒的与宿主特异性有关的226～228位对应的氨基酸均为TSS，具备人流感病毒的分子特征，暗示这两株病毒偏爱结合SA-α2,6-Gal受体，具备感染人的能力。

HA蛋白上潜在糖基化位点的增加，会改变病毒的抗原性或增强病毒的流行性，进而使其逃避宿主免疫[14]。研究发现HA蛋白上潜在糖基化位点较多的毒株往往能够在流行中形成稳定的谱系。不仅如此，糖基化位点的数量和位置可能会影响蛋白质的折叠、组装、聚集和转移[15]。进而能影响病毒的受体结合活性和抗原性。经氨基酸序列分析，2株病毒和人源H3N2亚型流感病毒在HA1蛋白上的133位(NGT)和246位(NST)多出2个潜在的糖基化位点。

PB2蛋白上的627位氨基酸与宿主特异性和病毒复制能力密切相关[16]，本研究两株病毒的627位氨基酸位点为人源K，推测这两株病毒具有感染哺乳动物的能力。流感病毒M2蛋白上的26位、27位、30位、31位和34位氨基酸与病毒的耐药性有关[17]，本研究的GD1519病毒在26位和31位发生了氨基酸突变，暗示该病毒可能对金刚烷胺产生了耐药性。研究证明NS1蛋白的42位和92位氨基酸与流感病毒的抗干扰素能力有关[18]。本研究的两株病毒在NS1蛋白的42位均发生了抗干扰素的氨基酸突变。

本研究中两株病毒的部分基因片段与河南、广东、湖南等毒株的对应片段高度同源，说明病毒可能是在生猪跨省流动过程中重组产生，这提示应当加强对SIV的主动监测，尤其是易感动物跨区域流动时的监测。对本研究中的两株SIVs的分子特征和遗传进化特性进行系统分析,结果显示其可能具有感染人的能力。因此，从公共卫生安全角度考虑，也应建立对SIV的流行监测工作机制，密切关注我国猪群中SIV的流行动态，及时掌握其分子遗传进化规律，这对确保人类健康和降低养猪业的经济损失都具有重要意义。