张巍远，王玉柳明，张宇坤，王贵玉

哈尔滨医科大学附属第二医院结直肠肿瘤外科 黑龙江哈尔滨 150081

结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，近年来，随着我国人民生活水平的提高与饮食习惯的改变，结直肠癌的发病率逐年上升，死亡率在恶性肿瘤中排名前列[1-3]。人体肠道中各类细菌总数达1×1014，种类超过1 000种[4-5]，具有复杂的微环境。近年来多项研究表明，人体肠道菌群与结肠肿瘤的关系密切，两者相互影响[6-7]。术后腹泻是一种常见的结肠癌术后并发症，然而术后腹泻在不同个体可表现出明显的差异性。因此本研究运用微生物16S rRNA第二代高通量测序技术与生物信息学、统计学分析的方法，尝试对比结肠癌术后发生腹泻患者与未发生腹泻患者术前肠道菌群特征的异同，探究患者术前肠道微生物特征与术后腹泻的关联性，寻找导致术后腹泻的可能原因，为防治术后腹泻提供新的治疗靶点与方向，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究纳入2018年7月至2019年1月在哈尔滨医科大学附属第二医院结直肠肿瘤外科就诊并进行根治性手术切除的结肠癌患者为研究对象，初始共收集研究样本65例，其中术后腹泻患者33例、术后未腹泻患者32例。术后腹泻患者入组标准：（1）通过肠镜病理活检诊断为原发性结肠恶性肿瘤；（2）进行原发灶根治切除手术；（3）术后排便次数≥3次/日，粪质变稀，无明显脓血；（4）可伴有腹痛、腹胀、里急后重、发热等症状。排除标准为：（1）样本采集前3个月内曾服用抗生素或皮质类固醇激素或益生菌者；（2）样本采集前1周内行灌肠治疗或肠镜检查或口服导泻剂者；（3）细菌性痢疾、肠道寄生虫、胃肠道神经内分泌瘤所致腹泻、肠结核、炎症性肠病以及胰源性腹泻；（4）特殊饮食者。本研究采用倾向值匹配法（PSM），将患者的性别、年龄、身体质量指数（BMI）、肿瘤部位和美国麻醉师协会（ASA）评分作为变量，运用Logistic回归模型分析变量所得出P值即为倾向值。按照最邻近匹配法（NNM）进行1:1配对，将卡钳值设置为0.01对患者进行筛选，经PSM后选出腹泻组（D组）与对照组（C组，未发生术后腹泻）患者各19例，见表1。本项研究通过哈尔滨医科大学附属第二医院伦理委员会审核，所有研究对象均同意采集样本并已签署书面形式的知情同意书。

表1 倾向值匹配结果

表1（续）

1.2 样本采集与处理

所有新鲜粪便样本（≥1 g）均于研究对象入院当天未经任何医疗处置前收集，样本收集于无菌冻存管内，放置于液氮中速冻后储存于-80℃冰箱内。粪便样本细菌的DNA的提取采用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒（德国QIAGEN公司生产）。具体步骤按照说明书操作，所提取的DNA于-80℃冰箱保存。对样本的16S rRNA的V3～V4可变区进行PCR扩增，使用的引物序列为338F5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。将纯化后的扩增片段构建成测序文库，并使用Illumina Miseq平台对其进行测序（测序部分由上海美吉生物医药科技有限公司完成）。

1.3 生物信息学分析与统计学分析

使用软件FLASH、Trimmomatic对测序数据进行处理，以97%相似度聚类得到操作分类单元（opera⁃tional taxonomicunits，OUT）结果，在OUT水平对各组进行统计学分析。

采用统计学软件SPSS 22.0进行倾向值匹配法与统计学分析。符合正态分布的计量数据采用（±s）表示，组间比较采用t检验；符合偏态分布的计量数据采用M（QL，QU）表示，组间比较采用非参数秩和检验。对于计数资料采用例数（n）表示，组间比较采用χ2检验或确切概率检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本分组分析

相似性分析（ANOSIM分析）结果R值为0.52、P值为0.001，采用unweighted_unifrac的方法计算组间或组内距离值，并将组内及组间距离值的结果绘制成盒状图（见图1）。两者提示了分组的正确性并且满足可进一步分析两组间差异的条件。

2.2 菌群组成分析及组间差异检验

首先从细菌“门”水平对两组样本进行群落分析：腹泻组丰度排前3位的分别是厚壁菌门（Fir⁃micutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Pro⁃teobacteria），分别占45.6%、24.4%、17.7%；对照组丰度排前3位的也是这三者，分别占48.8%、38.7%、8.8%。两组的优势菌种相同，但所占比例不同（见图2）。基于两组各菌群丰度进行组间差异检验并绘制柱状图（见图3），可见疣状菌门（Verruco⁃microbia）在腹泻组中丰度增多（P＜0.05），拟杆菌门（Bacteroidetes）与柔膜菌门（Tenericutes）的丰度在对照组更多（均P＜0.05）。

其次从细菌“属”水平对两组样本进行群落分析：腹泻组丰度排前5位的分别是拟杆菌属（Bacte⁃roides）、大肠杆菌志贺菌属（Escherichia Shigella）、肠球菌（Enterococcus）、梭菌属（Fusobacterium）、枸橼酸杆菌属（Citrobacter），分别占20.7%、11.1%、7.7%、4.7%、3.1%；对照组丰度排前5位的分别是拟杆菌属（Bacteroides）、普雷沃菌属（Prevotella_9），大肠杆菌志贺菌属（Escherichia Shigella）、粪杆菌属（Faecalibacterium）、瘤胃球菌属（Ruminococca⁃ceae-UCG-002），分别占15.3%、9.8%、6.7%、5.3%、3.9%。在菌属水平对比群落组成，两组间群落组成比例不同（见图4）。进行组间差异检验并绘制柱状图（见图5），可见肠球菌属（Enterococcus）在腹泻组中丰度增多（P＜0.05），普雷沃菌属（Pre⁃votella_9）与直肠真菌（Eubactaerium rectale）的丰度在对照组更多（均P＜0.05）。

图1 组间及组内距离值盒状图

图2 两组间肠道细菌“门”水平群落组成对比

图3 两组间肠道细菌“门”水平差异检验柱状图

图4 两组间肠道细菌“属”水平群落组成对比

图5 两组间肠道细菌“属”水平差异检验柱状图

2.3 多样性分析

首先对两组进行Alpha多样性分析：计算Sobs指数、Chao指数、Ace指数并进行对比，可得出两组间丰度有差异，计算出辛普森（Simpson）指数、香农（Shannon）指数进行对比，可得出两组间物种多样性有差异，见表2。在OUT水平绘制组间差异检验直方图，结果提示两组间物种多样性存在差异（P＜0.001），见图6。

其次采用PCoA分析方法对两组进行Beta多样性分析，应用unweighted_unifric算法，可见两组样本主成分存在差异（P＜0.01）。见图7。

表2 Alpha多样性指数表

图6 组间差异检验直方图（***表示P＜0.001）

图7 PCoA（主坐标分析图）

3 讨论

人体肠道内的微生物环境极其复杂，包含多种微生物，其中细菌占据了绝大多数。随着二代高通量测序技术的发展与广泛应用，近年来越来越多的研究关注肠道菌群与结直肠癌间的关联及影响[8-12]。结肠癌手术患者不同于其他肠道手术或腹腔手术的患者，其体内的肠道菌群与非癌症患者差异性较大。既往的研究大多关注于肠道细菌对结肠癌发生发展的影响，或健康人群与结肠癌患者间的对比，而关于肠道菌群与术后并发症的关系研究鲜有。本研究以结肠癌手术后常见的术后并发症——术后腹泻为研究内容，利用第二代高通量测序技术，对比术后发生腹泻患者与未发生腹泻患者的术前肠道菌群特征差异，试图从肠道微环境差异的角度解释患者术后腹泻原因。

引起患者腹泻的原因很多，包括细菌性痢疾、肠道寄生虫、胃肠道神经内分泌瘤所致腹泻、肠结核、炎症性肠病以及胰源性腹泻等。通过严格的入组与排除标准，本研究将其他原因导致腹泻的患者排除，便于进一步探究术前肠道菌群与术后腹泻的关联性。

本研究对比既往的研究有两点不同：（1）既往的研究多选用肠道黏膜或者肿瘤组织作为测序对象，但是通过手术或者肠镜等方式获取肠道黏膜组织，破坏了原有的肠道菌群的组成。本研究选用粪便样本作为测序对象，肠道中大部分定殖菌在粪便的形成过程中被冲刷下来，并且未破坏原有的肠道菌群环境[13-14]；（2）既往研究中的研究对象大部分为随机选取某一时段的入院患者，在对比组间菌群差异时无法排除选择偏移和个体基本信息差异。本研究使用了倾向值匹配法，两组研究对象间的基础状况更相近，使组间对比的结果可信度更高。

利用相似性分析的方法确认分组对比有意义后，Alpha多样性分析与PCoA分析提示两组菌群组成成分不同且差异明显。最后分别对两组样本在“门”“属”水平进行群落分析和差异性检验，术后腹泻的患者其术前肠道内的疣状菌门和肠球菌属丰度增高，拟杆菌门丰度减少。虽然结肠癌术后腹泻的病因仍不明，但肠道菌群失调被认为是可能导致其发生的原因之一[15]。由于肠道菌群失调导致肠内微生物的种类、含量、比例的改变，肠道内益生菌减少，对肠道黏膜的保护作用减弱，而致病菌增多，其释放的内毒素可以损伤肠道黏膜屏障，使黏膜通透性增加并产生局部炎性反应。肠道菌群失调也可以使肠内结合胆汁酸盐水解增多，影响脂质与脂肪的消化吸收，从而导致腹泻。此外，拟杆菌门中的非肠毒素脆弱拟杆菌被证明有减少炎症介质分泌、降低机体炎症反应的功能[16]，由于测序技术的限制无法区分非肠毒素脆弱拟杆菌与其他拟杆菌的具体含量差异，因此本研究推测非肠毒素脆弱拟杆菌的减少可能是造成术后腹泻的原因之一。

基于本研究认为，结肠癌术后发生腹泻的患者其术前肠道菌群特征可见有异于术后未发生腹泻的患者，肠道菌群的失调可能是导致腹泻发生的原因。其中疣状菌门和肠球菌属组间差异明显，且既往研究显示疣状菌门与肠球菌属都可能对结肠癌的发生发展产生影响[17-18]。除拟杆菌门中的非肠毒素脆弱拟杆菌外，造成结肠癌患者术后腹泻的病因也可能与疣状菌门和肠球菌属在不同个体间含量的差异相关。因此，在术前注重对患者肠道菌群进行调节，可能成为预防结肠癌术后腹泻发生的新的思考方向。