冯紫薇，张媛，2，孟磊，赵婷，2，石玥，魏胜利，2*

1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；2.中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京 100102

何首乌为蓼科植物何首乌PolygonummultiflorumThumb.的干燥块根，生何首乌性平偏凉，有解毒、截疟、润肠燥的功效，制何首乌又可以补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨，在药品、食品、保健品、化妆品业应用广泛[1]。现代研究表明，何首乌中有多种有效成分，反式二苯乙烯苷具有抗衰老、保护神经细胞、调节免疫、清除自由基、提高记忆力、保肝等多种药理活性[2]，游离蒽醌和结合蒽醌均有调节免疫、抗肿瘤的药理活性[3-5]，而结合蒽醌又有较强的泻下作用。与此同时，何首乌中产生肝毒性的成分也引起了大家的关注，有研究推测顺式二苯乙烯苷是何首乌特异性肝损伤的重要易感物质[6-7]，通过控制其含量可减轻何首乌的肝毒性。张乐等[8]通过对顺式二苯乙烯苷与肝损伤相关性的研究，初步得出了顺式二苯乙烯苷含量的建议安全限度为0.1%。何首乌的初加工技术虽然简单但对何首乌的质量影响甚大[9]。本研究拟通过以顺式二苯乙烯苷含量为毒性指标，以反式二苯乙烯苷、两游离蒽醌(大黄素、大黄素甲醚)和两结合蒽醌(大黄素葡萄糖苷、大黄素甲醚葡萄糖苷)的含量为功效指标，建立基于初加工技术的高反式二苯乙烯苷型、高游离蒽醌型和高结合蒽醌型3类优质何首乌药材定向加工生产体系[10]。

1 材料与方法

1.1 材料

Agilent Technologies 1260 Infinity型高效液相色谱仪系统(安捷伦科技有限公司)；ME104型万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；BT 25S型十万分之一电子分析天平(赛多利斯上海贸易有限公司)；KQ5200D型超声清洗器(江苏省昆山市超声仪器有限公司)；FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

甲醇(分析纯，北京化工厂)；甲醇(色谱纯，Fisher)；乙腈(色谱纯，Fisher)；屈臣氏蒸馏水；对照品2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、反式-二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷购自中国药品生物制品检定所，纯度均>98%，大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷(上海源叶生物科技有限公司，纯度>98%)。顺式-二苯乙烯苷自制，参考文献[11]方法，通过反式-二苯乙烯苷在紫外365 nm下转化而得，纯度>98%。

2年生何首乌块根经北京中医药大学魏胜利教授鉴定为蓼科植物何首乌P.multiflorumThumb.的块根。

1.2 方法

1.2.1样品处理 设置阴干、自然晾晒、真空干燥、微波干燥、40 ℃烘干、50 ℃烘干、60 ℃烘干、70 ℃烘干、80 ℃烘干9个处理，每个处理重复3次。

选取大小均一何首乌块根10个，切成边长为5 cm的方块，混合均匀后随机分为6组。其中1组直接切制成厚度为1 cm的片，置于50 ℃烘箱烘至干燥，不发汗处理。其余5组置于50 ℃烘箱，分别烘5、10、20、25 、30 h后取出，再发汗48 h，最后切制成厚度为1 cm的片50 ℃烘至干燥。

1.2.2含量测定 参考李雨萌等[12]HPLC一测多评法，对何首乌中的反式二苯乙烯苷、顺式二苯乙烯苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚6个成分进行含量测定，对照品和供试品溶液HPLC图见图1。

注：A.对照品溶液；B.供试品溶液；1.顺式二苯乙烯苷；2.反式二苯乙烯苷；3.大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷；4.大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷；5.大黄素；6.大黄素甲醚。图1 对照品和供试品溶液的HPLC图

1.2.3统计分析 所有数据均采用Microsoft Excel software 2010及SPSS 19.0统计软件进行统计分析。采用单因素方差分析(ANOVA)对Duncan′s进行单因素检验，其中P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同干燥方式对何首乌质量成分的影响

据表1、图2的何首乌不同干燥方式活性成分含量比较可知，晒干和阴干能使顺、反式二苯乙烯苷、大黄素苷、大黄素、大黄素甲醚等成分含量维持在较高水平，但晒干的何首乌中大黄素和大黄素甲醚2种游离蒽醌含量较低。真空干燥和微波干燥时顺、反式二苯乙烯苷含量均较低。真空干燥时大黄素苷含量较低而大黄素含量较高，微波干燥结果与之相反，大黄素甲醚苷含量较高、大黄素甲醚含量较低。在烘干的干燥方式中，随着烘干温度升高何首乌大黄素苷含量降低、大黄素含量升高，以60、70 ℃烘干为例，70 ℃烘干比60 ℃烘干大黄素苷含量降低了20.77%、大黄素含量升高了60.56%。反式二苯乙烯苷随温度升高有较弱的下降趋势，而顺式二苯乙烯苷未有明显规律。

表1 何首乌不同干燥方式活性成分质量分数 %

注：*P<0.05；**P<0.01。

注：A.顺式二苯乙烯苷；B.反式二苯乙烯苷；C.2种结合蒽醌；D.2种游离蒽醌。图2 何首乌不同干燥方式活性成分质量分数比较图

2.2 发汗前不同烘干时间对何首乌质量成分的影响

据表2、图3可知，随发汗前烘干时间的增加，何首乌中呈现出顺式二苯乙烯苷和大黄素含量逐渐升高、而反式二苯乙烯苷和大黄素苷含量逐渐降低的趋势，大黄素甲醚、大黄素甲醚苷无显著规律变化。蒽醌类成分尤其是大黄素苷和大黄素比二苯乙烯苷类含量受发汗前烘干时间影响更为显著。以发汗前烘10、20 h为例，大黄素苷在样品烘20 h后发汗烘干时比烘10 h后发汗烘干时含量下降了74.71%，而反式二苯乙烯苷此时含量仅下降了9.30%；大黄素在样品烘20 h后发汗烘干时比烘10 h后发汗烘干时含量升高了74.88%，而顺式二苯乙烯苷此时含量仅升高了34.28%。

3 结论与讨论

根据张乐等[8]的研究结果，将顺式二苯乙烯苷含量低于0.1%作为何首乌加工的安全限度，不同干燥方式和发汗前不同烘干时间的何首乌均能达到安全限度，在保障安全性的基础上进行基于初加工技术的不同类型何首乌定向加工研究。高含量反式二苯乙烯苷型何首乌定向加工方法为：将药材置50 ℃条件下烘5～10 h，发汗，晒干或阴干。高含量结合蒽醌型何首乌定向加工方法为：将药材置50 ℃条件下烘5～10 h，发汗，晒干。高含量游离蒽醌型何首乌定向加工方法为：将药材置50 ℃条件下烘25～30 h，发汗，真空干燥、阴干或70～80 ℃烘干。

3.1 干燥方式及发汗前不同烘干时间对二苯乙烯苷类成分含量影响

晒干和阴干的何首乌中顺、反式二苯乙烯苷含量较高，推测可能在适宜温度尤其是有适宜光照的条件下，何首乌中含有的可促使二苯乙烯苷合成的相关酶系活化，产生酶促效应使顺、反式二苯乙烯苷的量增加。真空干燥和微波干燥时顺、反式二苯乙烯苷含量均较低，文献报道二苯乙烯苷类热稳定性较差[13]，推测微波加热瞬时的高温会对二苯乙烯苷类成分产生破坏，真空干燥同时有高温和含水量迅速降低双重因素的影响，影响相关酶促效应的发生使反式二苯乙烯苷类含量更低。发汗前不同烘干时间实验的结果也证明了含水量对二苯乙烯苷类的影响，发汗前何首乌含水量越大顺、反式二苯乙烯苷含量越低，而反式二苯乙烯苷含量越高。

表2 何首乌发汗前不同烘干时间活性成分质量分数 %

注：*P<0.05；**P<0.01。

注：A.顺式二苯乙烯苷；B.反式二苯乙烯苷；C.2种结合蒽醌；D.2种游离蒽醌。图3 何首乌发汗前不同烘干时间活性成分质量分数比较图

3.2 干燥方式及发汗前不同烘干时间对蒽醌类成分含量影响

蒽醌类成分含量受干燥方式的影响较为明显。结合蒽醌含量以晒干方式最高，阴干次之，而游离蒽醌则以阴干方式含量最高。据报道，何首乌在干燥过程中结合蒽醌易被酶水解，阴干的温度适合水解酶发挥作用，结合型蒽醌的分解率高于晒干方式，所以导致结合型蒽醌的含量降低，游离蒽醌的含量升高[14]。晒干时的光照可能破坏水解酶活性，从而降低结合型蒽醌向游离型蒽醌的转化率，最终导致降低游离型蒽醌的含量。

3.3 何首乌定向加工的研究前景

反式二苯乙烯苷、结合型蒽醌和游离型蒽醌是何首乌中的3类主要活性成分。现代药理研究表明，反式二苯乙烯苷具有抗衰老、调节免疫、提高记忆力、抗血小板凝集等多种活性[2，15]，部分游离蒽醌有诱导癌细胞凋亡、逆转肿瘤多药耐药性、抑制金黄色葡萄球菌生长等药理活性[16-17]，结合蒽醌有较强的泻下作用[18]，该3类成分可能分别与补肝肾强筋骨、解毒截疟和润肠燥的功效相关联。高含量反式二苯乙烯苷型何首乌可能更侧重补益功效；高含量结合蒽醌型何首乌可能更侧重润肠燥作用；高含量游离蒽醌型何首乌可能有解毒截疟的作用趋势。随着何首乌毒性及功效物质基础的进一步研究和“精准医学” “精准药材”的发展，何首乌的定向加工将有望对临床中药的使用产生更加重要的作用。当然，本研究仅基于对何首乌生品的部分初加工技术进行讨论，定向加工对何首乌药效的影响仍需大量药理和临床试验验证。