刘赛，李建领，2，杨孟可，乔海莉，郭昆，徐荣，徐常青*，陈君*

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518110

宁夏枸杞LyciumbarbarumL.为茄科Solanaceae枸杞属Lycium多年生落叶灌木，是我国西北地区的重要经济作物，其干燥成熟果实枸杞子是我国传统名贵中药材[1]。宁夏枸杞在生长过程中极易遭受多种病虫为害，枸杞木虱BactericeragobicaLoginova是宁夏枸杞产区的主要害虫之一，在我国西北枸杞主产区普遍严重发生[2]。枸杞木虱每年发生4～5代，成虫活跃善跳，1龄若虫活动，2龄后固定在叶背取食，导致叶片干枯、早落，若虫分泌物也易招致煤污病的发生[3]，严重时导致枝条干枯，树势衰弱，抽发新枝困难甚至整株病死，产量绝收[4]。此外，枸杞木虱还是枸杞另一重要害虫枸杞瘿螨的携播越冬寄主[5-6]，枸杞瘿螨能否爆发与枸杞木虱种群数量密切相关[7-8]。枸杞木虱对枸杞生产威胁极大，严重影响了枸杞子的产量和质量，已成为制约枸杞产业发展的重要因子。

木虱为刺吸式口器害虫，主要在叶片、嫩梢和嫩芽上吸食寄主植物汁液，并不会直接破坏或杀死植物细胞；但由于其繁殖量大，种群数量多，过度吸食会对寄主植株产生影响[9]。枸杞木虱若虫期体型微小、体色淡，在叶背隐蔽取食，发生初期不易察觉，生产中通常不注意防控，使得该虫极易爆发成灾；而且在后期即便将该虫有效防控，其造成的损害也不可逆，严重影响枸杞树当年及来年发枝。目前，枸杞木虱对枸杞的影响仅见防治及产量损失等宏观研究[3，10]，对枸杞根系与生理生化等指标的影响少见报道，本研究以宁夏枸杞实生苗为试验材料，通过人工接种枸杞木虱，对比分析枸杞木虱取食为害过程对宁夏枸杞根系生长、光合作用及生理生化的影响，分析阐明枸杞木虱的为害特点，为枸杞木虱的科学防治提供依据。

1 材料

1.1 供试植株与虫源

枸杞实生苗：由宁夏枸杞(宁杞1号)种子培育，在光照培养箱中培养[(25±2)℃，60%±5% RH，16 h L∶8 h D]，至15～20片叶时备用。

枸杞木虱：采自中国医学科学院药用植物研究所枸杞试验田，室内光照培养箱(温湿度、光照同上)中枸杞实生苗上繁育保存。

1.2 仪器设备

光照培养箱(PRX-450 D，宁波赛福实验仪器有限公司)；十万分之一天平(XSE 205，梅特勒-托利多国际有限公司)；高速冷冻离心机[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；DHG-9143BS-Ⅲ烘箱(无锡市苏嘉试验设备厂)；JXFSTPRP-CL全自动样品研磨仪(上海实业发展有限公司)；紫外可见光分光光度计(UV-2550，日本岛津公司)；调制叶绿素荧光成像系统IMAGING-PAM(德国WALZ公司)；佳能LiDE210扫描仪、WinFOLIA叶面积分析系统(Regent Instruments Inc.)；Digimizer图像分析系统(MedCalc Software)。

1.3 化学试剂

总蛋白试剂盒(A045-2)、植物可溶性糖试剂盒(A145)、过氧化物酶(POD)试剂盒(A084-3)、苯丙氨酸转氨酶(PAL)试剂盒(A137)、多酚氧化酶(PPO)试剂盒(A136)、植物总酚试剂盒(A143)、植物类黄酮试剂盒(A142)均由南京建成生物工程有限公司生产。

2 方法

2.1 枸杞木虱接种

室内培育带有大量2龄木虱若虫的叶片，接种于健康枸杞苗，使木虱若虫主动转移至枸杞叶片。24 h后检查并保留2龄木虱若虫50～60头，去除多余若虫。对照组为同期长势一致的健康枸杞苗。

2.2 宁夏枸杞生长指标测定

接种木虱后第3、6、9、12天取样，每次每处理取5株枸杞苗作为5个重复。取样时将幼苗整株取出，根部浸于水中，轻抖去除泥土，洗净后以蒸馏水润洗，平铺于试验台用滤纸吸干水分。使用扫描仪获取叶片及根系图像，联合使用WinFOLIA和Digimizer软件对叶片面积及根系长度进行测量分析。扫描结束后，测定地上部分及根系鲜质量，然后将其置于80 ℃烘箱内烘干至恒重，测定干质量。

2.3 叶片光合参数测定

接种木虱后第3、6、9、12天进行叶绿素荧光测定，每次每处理取10株枸杞苗作为10个重复。测定前将枸杞苗暗处理30 min。接种第12天后，将处理与对照叶片同时置于叶绿素荧光成像系统载物盘，获得荧光参数成像。测定叶绿素荧光参数时，活化光打开前首先测定1次初始荧光值(Fo)和最大荧光值(Fm)，然后在自然光照下启动系列饱和脉冲，施加多次饱和闪光脉冲[6000 μmol·(m2·s-1)-1，脉冲时间为2 s]，每隔20 s测定1次，直至脉冲终止，取最后6次饱和闪光脉冲测量值的平均值，计算PSⅡ实际光合效率Yield，计算方法见参考文献[11]。

2.4 生理生化测定材料取样及测定

取样：接种木虱后第3、6、9、12天分别取样，每次每处理5个重复，每个重复采集6株枸杞苗。取样前，清除叶片上枸杞木虱若虫及蜜露，以蒸馏水冲洗去除各处理叶片的叶表灰尘，水分挥干后沿叶柄基部剪下叶位相近叶片，将叶片剪碎混匀，称量后装入离心管，迅速投入液氮中速冻30 s，置于-80 ℃冰箱保存。

样品前处理：每个测定指标5个重复，每个重复取样100 mg，使用全自动样品研磨仪在60 HZ、-20 ℃条件下振荡研磨90 s。

测定方法：可溶性蛋白测定使用总蛋白试剂盒(A045-2)，反应后在595 nm处测定吸光度。可溶性糖测定使用植物可溶性糖试剂盒(A145)，反应后在620 nm处测定吸光度。POD测定使用POD试剂盒(A084-3)，反应后在420 nm处测定吸光度。PAL测定使用PAL试剂盒(A137)，反应后在290 nm处测定吸光度。PPO测定使用PPO试剂盒(A136)，反应后在420 nm处测定吸光度。总酚测定使用植物总酚试剂盒(A143)，反应后在760 nm处测定吸光度。类黄酮测定使用植物类黄酮试剂盒(A142)，反应后在502 nm处测定吸光度。各测定指标的具体操作方法参照相应试剂盒使用说明。

2.5 数据分析

实验数据使用SPSS(v21，IBM)进行显著性分析。采用t检验法(t-test)对不同处理总蛋白，可溶性糖，植物POD、PAL、PPO活性，植物总酚，植物总黄酮，叶绿素荧光参数及叶片面积、根系长度，地上部分和地下部分鲜质量、干质量进行统计学分析。*P<0.05,**P<0.01表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 枸杞木虱对枸杞植株生长的影响

枸杞木虱为害可显著影响宁夏枸杞植株的生长。接种第3天，枸杞叶片面积和根系长度变化并不显著，随着接种天数的增加，枸杞木虱取食量逐渐增加，枸杞叶片及根系生长与对照相比受到显著抑制，第12天时，叶片面积和根系长度分别比对照减少了54.7%和47.3%。枸杞木虱为害显著抑制了枸杞植株地上、地下部分鲜质量及干物质积累，随为害时间的延长，植株地上、地下部分生长受到持续抑制，至第12天时，枸杞地上、地下部分鲜质量分别比对照组减失了52.1%和62.0%，干质量分别比对照组减失了60.0%和60.6%(见图1)。

3.2 枸杞木虱对枸杞叶片叶绿素荧光参数的影响

枸杞木虱为害可导致枸杞叶片光合效率下降(见表1)。Fo、Fm和PSⅡ实际光合效率Yield在接种枸杞木虱第3天与对照组差异无统计学意义，但随着枸杞木虱接种天数的增加，Fo、Fm和Yield开始显著下降，至第12天时，Fo、Fm和Yield分别比对照下降了15.7%，37.5%和28.8%。接种枸杞木虱第12天时，同一叶片不同部位之间各荧光参数有所差异(见图2)，叶片基部光合能力高于叶尖，表现出荧光异质性。枸杞木虱降低了枸杞叶片光合能力，同时加剧了叶片基部与叶尖之间的差异。

注：A. 枸杞木虱为害对枸杞叶片面积和根系长度的影响；B. 枸杞木虱为害对枸杞植株地上、地下部分鲜质量的影响；C. 枸杞木虱为害对枸杞植株地上、地下部分干质量的影响；*或#P<0.05；**或##P<0.01；ns表示差异无统计学意义(P>0.05)。图1 枸杞木虱为害对枸杞植株生长的影响

表1 枸杞木虱对枸杞叶片荧光参数的影响

注：**差异有统计学意义(P<0.01)。

注：CK为对照叶片；P为木虱为害的叶片；每个子图上的数字为实际测定值，单位为任意单位。图2 枸杞木虱接种第12天后枸杞叶片荧光参数成像

3.3 枸杞木虱对枸杞叶片生理生化的影响

枸杞木虱可导致枸杞叶片可溶性蛋白和可溶性糖含量降低(见表2)。木虱接种第36天与健康叶片相比差异无统计学意义，但随着枸杞木虱生长发育及取食量的不断增加，枸杞叶片可溶性蛋白和可溶性糖含量均显著下降，至第12天时，叶片可溶性蛋白和可溶性糖分别下降了15.9%和23.67%。枸杞木虱对枸杞叶片POD、PAL和PPO的影响无规律性变化。POD活力在枸杞木虱接种第3天时稍有上升，随后下降，至接种第9天时显著下降23.8%。枸杞木虱可致PAL活力整体呈下降趋势，但仅在第6天时才与对照有显著差异。枸杞木虱接种对PPO活力的影响表现出诱导效应，第3天和第6天时与对照无显著差异，至第9天时显著升高，第12天时又显著下降。枸杞木虱为害后可导致叶片总酚、类黄酮含量降低，除第9天无显著差异外，其他取样时间点均表现出显著下降趋势。

4 讨论

枸杞木虱为害可显著影响枸杞植株的正常生长，不但使地上部分生长受阻，而且还显著抑制根系生长。枸杞木虱取食量大，对植物营养的争夺明显，实验中在接种木虱第12天后枸杞幼苗即开始出现脱水萎蔫现象，生产中宁夏枸杞被木虱为害严重后也会导致叶片萎蔫，甚至枝条干枯，推测枸杞木虱取食量大是影响枸杞抽条发芽的主要原因。有研究显示木虱类害虫可抑制植物根系生长，如Nissinen等[12]发现胡萝卜Daucuscarota被胡萝卜木虱Triozaapicalis为害后，可导致胡萝卜地下部分明显缩小，本研究也发现枸杞木虱显著影响枸杞根系正常生长，推测这是导致被害枸杞植株恢复慢，甚至病死的重要原因。

表2 枸杞木虱对宁夏枸杞生理生化的影响

注：*P<0.05；**P<0.01。

枸杞木虱若虫通常固定在枸杞叶片背面刺吸为害，其对叶片的影响是渐进的且肉眼无法分辨，仅当枸杞遭受严重损伤时，枸杞叶片才出现发黄或干枯等明显症状。叶绿素荧光成像系统可以实时原位探测和研究植物光合生理变化及各种外界因子对其细微影响，具有快速、灵敏和非破坏性等优点[13-14]。接种枸杞木虱第6天，枸杞叶片叶绿素荧光参数值开始下降，且随为害时间的延长，荧光参数下降越显著，推测枸杞木虱取食为害枸杞叶片后，PSⅡ活性中心受到伤害，破坏了叶片光合机能，影响光合作用的正常进行，这与张文英等[15]利用LI-6400光合仪测定研究鸭脚树星室木虱Pseudophacopteronalstonium对糖胶树Alstoniascholaris致瘿后的结果类似，与陈建明、Watanabe等[16-17]关于水稻褐飞虱刺吸为害引起水稻叶片叶绿素崩解，光合作用强度下降，蛋白质分解，导致植株产生“虱烧”现象类似。

植物POD、PAL和PPO是植物体内重要的防御酶，参与活性氧清除[18]，酚类、木质素、生物碱[19]以及醌类等相关抗性物质的合成[20]，其中植物总酚和类黄酮对植食性节肢动物的取食和生长发育有抑制作用[21-22]，这些防御酶及抗性物质对增强植物抗病虫能力具有重要作用。本研究的结果显示，枸杞木虱为害可显著降低枸杞植株营养，但并未引起枸杞抗性相关酶(POD、PAL、PPO)活性和次生物质总酚(单宁为主)、类黄酮含量显著升高，甚至出现降低，与柑橘木虱Diaphorinacitri抑制柑橘Citrusreticulata或九里香Murrayapaniculata叶片防御酶(SOD、POD等)活性[23]、桉树木虱Glycaspisbrimblecombei抑制桉树Eucalyptuscamaldulensis叶片多酚类物质含量[24]的研究结果类似。同时，枸杞木虱也可能通过大量摄取植物营养，导致植物体内合成防御酶原料不足而使其活性受到抑制，酚类物质合成减少[24-25]，具体原因有待进一步研究。