宋剑婵，于秀杰，司婧文，刘易欣

1天津医科大学，天津 300070；2天津市中心妇产科医院

卵巢上皮性肿瘤是常见的妇科肿瘤性疾病，其中卵巢癌的病死率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢癌患者的低生存率与其恶性浸润转移有关，而卵巢癌细胞侵袭转移能力的关键因素之一是肿瘤缺氧微环境[1]。缺氧诱导因子(HIFs)是一种蛋白质，可促进基因转录，并对组织中含氧量的降低产生生理反应，激活特定基因的表达[2]。其中HIF-1α是调节肿瘤细胞适应低氧的核心转录因子，为全局性调控缺氧应答的因子，在肿瘤的能量代谢、血管形成、侵袭转移等方面发挥重要作用。此外，癌症的转移是一个多步骤过程，开始于细胞的上皮—间质转化(EMT)，通常发生在肿瘤转移的起始阶段，发生EMT的上皮细胞在经历了短暂的结构改变后，其细胞表型亦发生改变，E-钙黏蛋白(E-cadherin)等上皮表型的特征性蛋白减少，而N-钙黏蛋白(N-cadherin)等间质细胞表型的特征性蛋白增多[3]。研究证实，肿瘤细胞内部HIF-1α与EMT相关转录因子的表达相互协同，HIF-1α能直接或间接地调控、诱导EMT相关基因的表达，并能调节各个因子间的相互作用，进而促进EMT形成[4]。2017年3月，我们探讨了不同卵巢上皮性肿瘤组织中HIF-1α、E-cadherin和N-cadherin的表达变化及意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2011年1～12月天津市中心妇产科医院原发卵巢上皮性肿瘤患者161例，且术前均未予以放、化疗治疗，其中良性肿瘤51例(浆液性肿瘤17例，黏液性肿瘤17例，宫内膜样肿瘤17例)，交界性肿瘤48例(浆液性肿瘤25例，黏液性肿瘤14例，浆黏液性肿瘤6例，宫内膜样肿瘤2例，透明细胞肿瘤1例；FIGO分期Ⅰ期44例，Ⅱ期3例，Ⅲ期1例，Ⅳ期0例)，恶性肿瘤62例，浆液性癌43例(低级别浆液性癌11例，高级别浆液性癌30例)，黏液性癌4例，宫内膜样癌5例，透明细胞癌12例，Kurman分型Ⅰ型癌29例(低级别浆液性癌11例，黏液性癌4例，低级别宫内膜样癌2例，透明细胞癌12例)，Ⅱ型癌33例(高级别浆液性癌30例，中、高级别宫内膜样癌3例)；FIGO分期Ⅰ期20例，Ⅱ期12例，Ⅲ期28例，Ⅳ期2例。

1.2 卵巢上皮性肿瘤组织中HIF-1α、E-cadherin及N-cadherin表达检测 采用免疫组化SP染色法。石蜡切片脱蜡水化：环保脱蜡剂8 min×3→无水乙醇2 min×3→95%乙醇2 min→80%乙醇2 min→流水冲洗→蒸馏水洗5 min；PBS缓冲液冲洗，3 min×3；抗原修复：将1 000 mL抗原修复液置于高压锅内加热至煮沸，切片置于切片架上放入锅中，液面要高于切片，高温高压修复3 min，自然冷却至室温；PBS缓冲液冲洗，3 min×3；3%H2O2溶液室温避光孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶；PBS缓冲液冲洗，3 min×3；滴加一抗[一抗鼠抗人HIF-1α(ESEE122)单抗浓缩液购于美国Novus Biological公司，工作浓度1∶1 200；一抗鼠抗人E-cadherin和鼠抗人N-cadherin均为单抗工作液，购于北京中杉金桥公司]，切片水平置于湿盒中，恒温箱37 ℃孵育1 h；PBS缓冲液冲洗，3 min×3；滴加二抗，切片水平置于湿盒中，恒温箱37 ℃孵育30 h；PBS缓冲液冲洗，3 min×3；DAB显色：统一时间滴加新配制的DAB工作液，显微镜下观察，当目标部位出现棕黄色颗粒时，统一时间于自来水中冲洗，终止显色；充分水洗，苏木素复染细胞核，分色、返蓝，流水冲洗；脱水透明：80%乙醇2 min→95%乙醇2 min→无水乙醇2 min×3→环保脱蜡剂2 min×3；中性树胶封片。检测系统为美国DAKO公司的抗兔/鼠通用型试剂盒(EnVisionTM+加强型)，包括：A瓶：ChemMateTMEnVision+/HRP(兔/小鼠)；B瓶：DAB 缓冲稀释液；C瓶：DAB原液。HIF-1α以胎盘作为阳性对照，E-cadherin以乳腺浸润性导管癌作为阳性对照，N-cadherin以心肌作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液 (PBS) 代替一抗作为阴性对照，每例切片均常规进行苏木素-伊红染色。

1.3 结果判定 HIF-1α以细胞核或细胞质内出现棕黄色颗粒视为阳性表达，先按染色强度，无色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；再按阳性细胞所占百分比，阳性细胞数≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥75%为4分；染色强度与阳性细胞百分比的乘积:<2为阴性表达，≥2为阳性表达[5]。

E-cadherin主要表达于细胞膜上，染色阴性或阳性率≤10%为0分；弱阳性表达且阳性率≥10%为1分；中等强度阳性表达且阳性率≥10%为2分；与正常组织表达强度相同视为强阳性表达，且阳性率≥10%为3分；0分、1分和2分为低表达，3分为正常表达[5]。

N-cadherin主要表达于细胞膜上，先按染色强度，无色0分，弱阳性1分，中等强度阳性2分，强阳性3分；再按阳性细胞所占百分比，阳性细胞数<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，≥51%为3分；染色强度与阳性细胞百分比的乘积:0分(-)～1分(+)为正常表达，2～4分(++)及6～9分(+++)为过表达。

1.4 统计学方法 采用SAS9.4统计软件。定性资料采用“例数(百分比)”表示，数据比较采用χ2检验、Fisher精确检验、Wilcoxon秩和检验、Kruskal-Wallis检验。HIF-1α表达与E-cadherin表达的关系采用Fisher精确检验，HIF-1α表达N-cadherin表达的关系采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-1α表达与肿瘤性质、组织分化程度及FIGO分期的关系 HIF-1α表达在良性、交界性、恶性肿瘤中逐渐增高，差异有统计学意义(P<0.000 1)；HIF-1α表达与卵巢癌组织分化程度有关，即分化越差的卵巢癌，HIF-1α评分越高(P=0.004 1)；HIF-1α表达与卵巢肿瘤分期有关(P=0.000 3)，分期越高，HIF-1α表达评分越高，见表1。

表1 HIF-1α表达与肿瘤性质、组织分化程度及FIGO分期的关系[例(%)]

2.2 E-cadherin表达与肿瘤性质、组织分化程度及FIGO分期的关系 E-cadherin表达随着肿瘤恶性程度增加逐渐下降，差异有统计学意义(P<0.001)；E-cadherin在卵巢癌中均呈低表达，不同分化程度的卵巢癌间表达差异无统计学意义，E-cadherin表达与卵巢肿瘤分期无关(P=1.000)，见表2。

表2 E-cadherin表达与肿瘤性质、组织分化程度及FIGO分期的关系[例(%)]

2.3 N-cadherin表达与肿瘤性质、组织分化程度及FIGO分期的关系 N-cadherin表达在良性、交界、恶性肿瘤中呈递增趋势，差异有统计学意义(P<0.001)；在卵巢癌中N-cadherin蛋白均呈高表达，但不同组织分化程度的卵巢癌间表达差异无统计学意义(P=0.594)；N-cadherin表达与卵巢肿瘤分期有关(P=0.020)。FIGO分期越高，N-cadherin表达阳性程度越高，见表3。

2.4 HIF-1α与E-cadherin、N-cadherin表达的关系 HIF-1α评分<2分时，E-cadherin低表达率为51.72%(30/58),正常表达率为48.28%(28/58)；HIF-1α评分≥2分时，E-cadherin低表达率为76.70%(79/103),正常表达率为23.30%(24/103)，HIF-1α评分与E-cadherin表达有关(P=0.001 6)。HIF-1α评分<2分时，N-cadherin表达+者占比41.38%(24/58),++者占比29.31%(17/58)，+++者占比29.31%(17/58)；HIF-1α评分≥2分时，N-cadherin表达+者占比23.30%(24/103),++者占比24.27%(25/103)，+++者占比52.43%(54/103)；HIF-1α评分与N-cadherin表达有关(χ2=8.925 1，P= 0.011 5)。

3 讨论

HIF-1是由α和β两个亚单位组成的异二聚体蛋白，α亚单位是HIF-1的功能单位，决定HIF-1的活性[6]。研究证明，HIF-1α在缺氧条件下的转录过程中具有核心作用。常氧条件下HIF-1α迅速被降解而维持在较低水平，缺氧条件下其降解受到抑制从而稳定存在，并与HIF-1β形成有活性的HIF-1二聚体DNA结合蛋白，调节下游的基因转录。HIF-1α在卵巢恶性肿瘤中的过表达已得到公认[7]，但其在卵巢交界性肿瘤中的表达及HIF-1α与肿瘤的组织学分级和分期的关系尚不明确。本研究结果显示，HIF-1α表达与卵巢良性肿瘤、交界性肿瘤、恶性肿瘤中的阳性表达呈增高趋势，HIF-1α与肿瘤的组织学分化程度有关，高分化肿瘤较低分化肿瘤的HIF-1α阳性率和阳性指数更高，且肿瘤分期越高，HIF-1α表达评分越高。

E-cadherin是一种钙依赖性跨膜糖蛋白，位于染色体的16q22.1，是钙黏蛋白分子家族的成员之一，能调节细胞间的相互作用[8]。E-cadherin定位于细胞与细胞的边界处，强烈表达于黏附连接中，从而维持上皮细胞的完整性和极性。E-cadherin缺失或表达下调可导致上皮细胞失去细胞间的黏附，并获得间质细胞特性，具有更强的运动性和侵袭性[9]，这一过程被称为EMT。研究表明，EMT不仅在胚胎发育过程中，而且在癌症进展等病理条件下有关键性作用。至今诸多研究证实，E-cadherin失表达与卵巢癌晚期的肿瘤进展和预后不良密切相关，其机制可能是E-cadherin基因突变、E-cadherin启动子高甲基化、RNA转录抑制或基质酶活化[10]。然而对E-cadherin低表达与卵巢癌组织学分级的关系目前尚存在争议，部分研究认为，E-cadherin低表达与卵巢癌高组织学分级和子宫肌层深部浸润有关，而另有部分研究提出了相反的结论。本研究结果显示，E-cadherin表达均与卵巢上皮性肿瘤性质相关，E-cadherin低表达率在良性肿瘤、交界性肿瘤、恶性肿瘤中逐渐上升；而E-cadheri表达与肿瘤的组织分化程度和FIGO分期无关。

N-cadherin是一种间质标志物，与E-cadherin同属钙黏蛋白家族六个基因家族中的经典钙黏蛋白Ⅰ型，是一种更具移动性和侵袭性的表型[11]。生理条件下，N-cadherin表达于神经、肌肉和造血等神经外胚层及中胚层来源的组织，而正常上皮组织通常不表达。“钙黏蛋白转换”现象是卵巢上皮性肿瘤EMT过程的关键特征，即E-cadherin表达下调的同时N-cadherin表达上调。现已证实，乳腺癌、前列腺癌、尿路上皮癌和胰腺癌等上皮性癌均与N-cadherin表达上调有关[12]，虽然其表达不被认为是致癌的，也不被认为是实体肿瘤生长的启动子[13]，但实验证据表明，N-cadherin可驱使肿瘤细胞向周围细胞间质迁移，从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移[14]。然而，目前关于N-cadherin在实体肿瘤中的预后价值仍存有争议。我们的研究结果显示，随着肿瘤恶性程度则增加，N-cadherin的表达逐渐增高，且FIGO分期越高，N-cadherin过表达越高，这说明N-cadherin在卵巢上皮性恶性肿瘤的疾病进展中可能发挥了一定作用，其作用依据有待进一步研究。此外，本研究结果表明，HIF-1α表达阳性时，E-cadherin低表达增强，与此同时N-cadherin过表达增强，进一步证实在卵巢上皮性肿瘤中的发展中，缺氧微环境诱导了EMT的发生。

综上所述，在卵巢癌中，E-cadherin呈低表达，N-cadherin、HIF-1α呈高表达，HIF-1α与N-cadherin促进卵巢癌的浸润和转移，HIF-1α促进卵巢癌细胞的分化，三者共同促进卵巢上皮性肿瘤的发展。