季拓，蒋政干，王祺，常宝元

安徽省宿州市立医院，安徽宿州 234000

膀胱尿路上皮癌是最常见的膀胱癌之一，主要起源于上皮组织的常见泌尿系统肿瘤，发病率、复发率及病死率高。据流行病学统计[1]，我国男性膀胱尿路上皮癌的发病率在恶性肿瘤中位居第7位，较女性多见，且发病年龄呈年轻化趋势。凋亡抑制因子1(CIAPIN1)属于细胞死亡抑制因子，其位于染色体 16q13，内含7个内含子和8个外显子[2]。研究[3]表明，CIAPIN1能激活受体依赖性激酶Ras信号通路，抑制细胞凋亡的同时促进细胞增殖。此外，CIAPIN1通过靶向作用于MMPs，进而调控ERK1/2信号通路，加速癌细胞的侵袭和转移[3]。Fibulin-3又称EFEMP1，属于细胞外基质糖蛋白，主要存在于上皮细胞基膜、内皮细胞基膜及密集间充质中，能维持细胞外环境的稳定性和完整性[4]。Fibulin-3是构成细胞外基质的重要组成蛋白，通过调控微环境与细胞的相互作用，进而对肿瘤细胞的增殖、分化及迁移产生影响[5]。目前，CIAPIN1和Fibulin-3在膀胱尿路上皮癌中研究较少，其作用机制及相关性尚不清楚。本研究旨在探讨膀胱尿路上皮癌组织中CIAPIN1、Fibulin-3的表达，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年1月～2019年3月我院收治的73例膀胱尿路上皮癌患者，纳入标准：①均符合《世界卫生组织肿瘤分类诊断系统》[6]中的诊断原则且术后病理证实为尿路上皮癌；②均首次诊断为膀胱尿路上皮癌，且既往无膀胱手术史及放化疗史；③患者的基本信息齐全，且愿意协助本次试验。排除标准：①合并输尿管或膀胱结核者；②严重尿路感染者；③肝肾功能失代偿者；④合并其他原发恶性肿瘤者。患者男51例、女22例，年龄(59.12±6.93)岁。有淋巴结转移者7例，无淋巴结转移者66例；高分化者43例、中分化者22例、低分化者8例;肿瘤直径≤5 cm者40例，>5 cm者33例；TNM分期Ⅰ期41例、Ⅱ期20例、Ⅲ期9例、Ⅳ期3例。本研究通过我院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 膀胱尿路上皮癌及其相应癌旁正常组织中CIAPIN1、Fibulin-3表达检测 采用qRT-PCR法。将术中取样的癌组织及其相应癌旁正常组织(距癌组织边缘>5 cm)暂存于液氮中，术后迅速移至-80 ℃冰箱中保存。两种组织均取50 mg，在冰上研磨后，各加入1 mL TRIzol试剂(Invitrogen公司)，严格遵循操作流程提取总RNA。采用Prime ScriptTMRT reagent kit试剂盒(TaKaRa公司)将10 μg总RNA反转录为cDNA。通过SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(TaKaRa公司)测量CIAPIN1和Fibulin-3的相对表达量。CIAPIN1和Fibulin-3的反应条件均为25 ℃ 10 min，37 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min。CIAPIN1正向引物：5′-GAGCTGCTGGATCCAGAAGATTTGAAG-3′,反向引物：5′-CAGGTAGCAGTTTCCACAAGCTGAC-3′;内参基因GAPDH正向引物：5′-GGGTGTGAACCATGAGAAGTATGAC-3′,反向引物：5′-GTGGTCATGAGTCCTTCCACGATACC-3′；Fibulin-3正向引物：5′-TGTATGTGCCCCCAGGGATA-3′,反向引物：5′-AACGGAAGCCGCCATGATAA-3′;内参基因GAPDH正向引物：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,反向引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。CIAPIN1和Fibulin-3的PCR反应条件均为95 ℃ 3 min、变性94 ℃ 30 s、退火56 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 45 s，共反应40 个循环，每个样本检测次数均为3次。以上引物序列均由上海生工公司制作合成。通过相对Ct值法检测二者表达量，结果采用 Ct值表示，CIAPIN1和Fibulin-3的表达量相对于GAPDH的比值为2-ΔΔCt，其中 Ct= C目的基因-Ct内参基因。

2 结果

2.1 膀胱尿路上皮癌及癌旁正常组织中CIAPIN1和Fibulin-3表达比较 膀胱尿路上皮癌组织及癌旁正常组织中CIAPIN1的相对表达量分别为4.67±1.02、1.98±0.67，而Fibulin-3的相对表达量分别为5.41±1.53、1.82±0.56。膀胱尿路上皮癌组织中CIAPIN1和Fibulin-3的相对表达量均较癌旁正常组织中增加(t分别为18.833、18.826，P均为0.000)。

2.2 膀胱尿路上皮癌组织中CIAPIN1和Fibulin-3表达与患者临床病理特征的关系 膀胱尿路上皮癌组织中CIAPIN1和Fibulin-3表达与TNM分期和淋巴结转移有关(P均<0.05)，而与患者性别、组织分化程度、肿瘤直径及年龄无关(P均>0.05)，见表1。

表1 膀胱尿路上皮癌组织中CIAPIN1和Fibulin-3表达与患者临床病理特征的关系

2.3 膀胱尿路上皮癌组织中CIAPIN1和Fibulin-3表达的关系 膀胱尿路上皮癌组织中CIAPIN1和Fibulin-3表达呈正相关(r=0.797，P=0.000)。

3 讨论

膀胱尿路上皮癌属于常见的泌尿系统恶性肿瘤，其在膀胱癌的发病率和病死率均居首位，且近年发病率呈增长趋势[7]。膀胱尿路上皮癌的主要病理分型是移行上皮细胞癌，其中非肌层浸润性膀胱癌约占70%[8]。膀胱尿路上皮癌的发生发展是多基因、多步骤及多因素共同协调的过程，其中染色体畸变、基因突变以及表观遗传修饰均起到重要作用[9]。目前，膀胱尿路上皮癌的治疗主要是膀胱全切术或经尿道电切术，并联合药物化疗及免疫治疗，然而膀胱尿路上皮癌的复发率极高且易于进展为肌层浸润性膀胱尿路上皮癌，因此手术治疗效果并不理想[10]。近年来，随着膀胱癌分子机制研究的不断深入，原癌基因与抑癌基因活性的失调、DNA甲基化及组蛋白修饰均对膀胱癌的发生进展产生重要影响，已成为目前研究的热点。

CIAPIN1是一种细胞死亡抑制因子，其长度约为939 bp，主要分布于核仁中，由C-末端中的锌指样结构和N-末端中的甲基转移酶结构构成[11]。CIAPIN1能调控细胞有丝分裂进程，缩短G1/S期，加速肿瘤细胞的分裂和增殖[12]。研究[12]表明，抑制CIAPIN1表达能减缓血管内皮细胞增殖速度，降低癌组织中供血血管密度，进而阻碍癌细胞的分化和转移。本研究结果显示，膀胱尿路上皮癌组织中CIAPIN1的表达高于癌旁组织，差异有统计学意义。原因可能为癌组织中的生长因子(如红细胞生成素、白细胞介素-3及干细胞因子)表达增加，进而刺激CIAPIN1，使其在癌组织中表达上调[13]。此外，癌组织中的RAS信号转导通路被激活，通过正反馈调节CIAPIN1表达量增加[14]。本研究结果显示，膀胱尿路上皮癌组织中CIAPIN1的表达与TNM分期、淋巴结转移有关，且恶性度越高，其表达量越高，表明CIAPIN1在膀胱尿路上皮癌的侵袭和转移中发挥重要作用。其原因可能为CIAPIN1通过激活NF-κB信号通路，从而降解IKBα、磷酸化p65，最终抑制癌细胞凋亡并使癌细胞增殖速度加快[15]。CIAPIN1能促进Jak2和Bcl-xL表达，阻止癌细胞凋亡并增强其耐药性，有助于癌细胞的侵袭和转移。此外，CIAPIN1可以通过Cyclin E/CDK2和Cyclin D1/CDK4途径调节G1/S期，促进肿瘤的分裂和分化，提高其恶性程度[16]。

Fibulins属于细胞外基质糖蛋白家族，由C端Fibulin样结构域和钙结合表皮生长因子模块构成。Fibulin-3是一种分泌型糖蛋白，主要位于染色体2p16，包含493个氨基酸和11个外显子，能维持基底膜、疏松结缔组织及弹性纤维的稳定，同时对细胞-细胞和细胞-基质间的信号传导有重要调控作用[17]。研究[18]表明，在卵巢癌组织中，Fibulin-3能激活部分血管生成因子，进而调节肌动蛋白细胞重组，增强癌细胞的侵袭和转移能力。本研究结果显示，膀胱尿路上皮癌组织中Fibulin-3的表达高于癌旁正常组织，差异有统计学意义。其原因可能为癌细胞由于基因突变使其无限增殖，进而分泌大量的黏多糖、糖蛋白和胶原蛋白等细胞外基质(ECM)物质，而Fibulin-3是ECM的一员，因此其表达量在膀胱尿路上皮癌组织中上调[19]。本研究结果显示，膀胱尿路上皮癌组织中Fibulin-3的表达与TNM分期、淋巴结转移有关，且恶性度越高，其表达量越高。其原因可能为Fibulin-3通过与表皮生长因子受体(EGFR)结合，使Tyr-1068和Tyr-992磷酸化，进而激活AKT和p44/p42 MAPK信号通路，加速癌细胞增殖[20]。研究[20]表明，Fibulin-3能调节Notch通路，增强基底细胞黏附能力，进而促进癌细胞的侵袭和转移，此外，Fibulin-3可上调基质蛋白酶MMP-2/MMP-9及ADAMTS-5的表达，降解ECM，从而为癌细胞转移提供生理条件。

本研究结果显示，癌组织中的CIAPIN1表达和Fibulin-3表达呈正相关关系，表明CIAPIN1和Fibulin-3协同作用加速膀胱尿路上皮癌的发病及演化。其机制可能为Fibulin-3能介导NF-κB通道激活金属酶AEG-1和MMP-2，促进癌细胞的转移，而CIAPIN1亦能调控NF-κB信号通路，从而抑制癌细胞凋亡，最终导致肿瘤进展。由此可见，二者均通过NF-κB信号通路促进肿瘤恶化。因此CIAPIN1和Fibulin-3可能起到协同作用，加速膀胱尿路上皮癌的进展[15,21]。

综上所述，膀胱尿路上皮癌组织中CIAPIN1和Fibulin-3表达增加，二者可能共同促进膀胱尿路上皮癌发生发展；检测二者表达有助于患者病情判断。