蔡 林 李 毅

（川北医学院， 四川 南充637000）

朴沉化郁丸收载于2015 年版《中国药典》 一部，由厚朴（姜制）、陈皮、香附（醋制）、延胡索（醋制）、枳壳（麸炒）、檀香等18 味药材加工而成，具有舒肝化郁、开胃消食的功效，临床上用于治疗胸腹胀满、消化不良、呕吐恶心、停食停水、气滞闷郁、胃脘刺痛等病症［1］。

中成药复方制剂由多味中药材加工而成，每味均含有多种成分，临床作用机制较为复杂，导致其质量控制研究面临诸多困难。当前，大部分中成药复方制剂采用单一指标控制模式，难以全面反映其品质；多指标控制模式近年来已逐步应用于相关质量控制中，但存在对照品不易获得、使用量大、检验成本高等诸多不足。一测多评法利用中药所含各成分之间存在的内在函数关系，通过测定1 种对照品稳定易得、价格低廉的成分，建立相对校正因子来计算其他成分含有量，以实现多种成分同时定量测定，可大大降低成本。因此，本实验采用该方法同时测定朴沉化郁丸中柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄 酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱、四氢小檗碱的含有量，不仅可全面控制产品质量，而且解决了对照品难以获得、价格昂贵的问题，从而实现该制剂多指标质量评价模式。

1 材料

Waters e2695型高效液相色谱仪购自美国Waters 公司；Agilent 1100型高效液相色谱仪购自美国Agilent 公司；AB135-S型电子天平购自梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司；CY-5000型超声波清洗器购自宁波新芝生物科技股份有限公司。

橙皮苷（批号110721-201818，纯度96.2%）、α-香附酮（批号110748-201815，纯度99.7%）、延胡索乙素（批号110726-201819，纯度99.8%）对照品均购于中国食品药品检定研究院；川陈皮素（批号15032717，纯度98.3%）、柚皮芸香苷（批号14090302，纯度99.5%）、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮（批号15042302，纯度99.5%）、四氢小檗碱（批号PRF8050941，纯度98.8%） 对照品均购于成都普瑞法科技开发有限公司；紫堇碱（批号17110821，纯度99.6%）、去氢紫堇碱（批号16040732，纯度98.8%） 对照品均购于上海同田生物技术股份有限公司。厚朴（姜制）、陈皮、香附（醋制）、延胡索（醋制）、枳壳（麸炒）、檀香、木香、片姜黄、柴胡、丁香、沉香、高良姜、青皮（醋制）、甘草、豆蔻、莪术（醋制）、砂仁、肉桂均购自四川省中药饮片有限责任公司，经川北医学院李毅主任中药师鉴定为正品，按各药材质量标准检验均符合规定。朴沉化郁丸（9 g／丸，批号4920096、4920101、4920115） 购自天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Xbridge C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -0.1% 冰醋酸（B）［2-4］，梯度洗脱（0～14.0 min，25.0%A；14.0～24.0 min，25.0%～40.0% A；24.0～39.0 min，40.0%～70.0%A；39.0～59.0 min，70.0%～81.0%A；59.0～65.0 min，81.0%～25.0%A）；体积流量0.9 mL／min；柱温30℃；检测波长300 nm（0～31.0 min，柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄 酮）［5-6］、242 nm（31.0～39.0 min，α-香附酮）［7］、280 nm（39.0～65.0 min，延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱、四氢小檗碱）［1，8-10］；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱、四氢小檗碱对照品适量，70%乙醇分别制成每1 mL 含1.558、1.814、0.492、0.338、0.734、0.146、0.212、0.178、0.132 mg 上述成分的贮备液，分别精密吸取2.5 mL 置于50 mL 量瓶中，70%乙醇制成含柚皮芸香苷77.9 μg／mL、橙皮苷90.7 μg／mL、川陈皮素24.6 μg／mL、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮16.9 μg／mL、α-香附酮36.7 μg／mL、延胡索乙素7.3 μg／mL、去氢紫堇碱10.6 μg／mL、紫堇碱8.9 μg／mL、四氢小檗碱6.6 μg／mL的溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备 取丸剂适量，剪碎，混匀，取约5.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 70% 乙醇，称定质量，加热回流提取45 min，放冷，70% 乙醇补足减失的质量，摇匀，离心5 min，取上清液，即得。

2.4 阴性样品溶液制备 按丸剂处方和工艺，分别制得缺陈皮、枳壳、青皮，缺香附，缺延胡索的阴性样品，按“2.3” 项下方法制备，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性考察 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分与其他成分均能达到基线分离，分离度均大于1.5，理论塔板数以各成分计均不低于3 500，阴性无干扰。

2.5.2 线性关系考察 精密吸取“2.2” 项下贮备液各2.0 mL，置于同一20 mL 量瓶中，70% 乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液A，精密吸取适量，70% 乙醇依次稀释2、4、8、16、20 倍，分别作为对照品溶液B～F，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5.3 精密度试验 精密吸取“2.2” 项下对照品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱、四氢小檗碱峰面积RSD 分别为 0.60%、0.53%、1.74%、0.93%、0.87%、1.18%、1.02%、1.29%、1.35%，表 明仪器精密度良好。

2.5.4 重复性试验 取同一批丸剂适量，按“2.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱、四氢小檗碱含有量RSD 分别为1.44%、1.27%、0.56%、1.60%、1.36%、0.89%、1.72%、1.86%、0.97%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液，室温下，于0、2、4、8、12、16 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱、四氢小檗碱峰面积RSD 分别为0.63%、0.58%、1.69%、0.88%、0.52%、1.07%、0.98%、1.26%、1.41%，表明溶液在16 h 内稳定性良好。

2.5.6 加样回收率试验 取同一批含有量已知的丸剂适量，剪碎后取9 份，每份约2.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，按照2015 年版《中国药典》 四部药品质量标准分析方法验证指导原则要求，精密吸取对照品溶液（含柚皮芸香苷0.882 mg／mL、橙皮苷1.056 mg／mL、川陈皮素0.322 mg／mL、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮0.178 mg／mL、α-香附酮0.544 mg／mL、延胡索乙素0.098 mg／mL、去氢紫堇碱0.136 mg／mL、紫堇碱0.114 mg／mL、四氢小檗碱0.078 mg／mL）0.5、1.0、1.5 mL 各3 份，按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱、四氢小檗碱平均加样回收率分别为98.59%、99.56%、97.94%、96.99%、99.91%、98.38%、99.12%、98.99%、97.49%，RSD 分别为1.28%、0.67%、1.45%、1.34%、0.98%、0.81%、1.17%、1.62%、0.84%。

2.5.7 相对校正因子测定 取“2.6” 项下对照品溶液A～F，在 “2.1” 项色谱条件下进样测定。以延胡索乙素为内标，计算其他8 种成分的相对校正因子（f内／待），公式为f内／待＝f内／f待＝（A内×C待） ／（A待×C内），其中A内为延胡索乙素峰面积，C内为延胡索乙素质量浓度，A待为待测成分峰面积，C待为待测成分质量浓度，结果见表2。

表2 各成分相对校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.6 耐用性考察

2.6.1 仪器、色谱柱 取“2.1.2” 项下对照品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，考察Waters e2695、Agilent 1100 色谱仪，以及Waters Xbridge C18、Agilent Extend C18、Kromasil C18色谱柱对相对校正因子的影响，结果见表3，可知均无明显影响（RSD＜2.0%）。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.6.2 体积流量 取“2.1.2” 项下对照品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，考察体积流量0.8、0.9、1.0 mL／min 对相对校正因子的影响，结果见表4，可知均无明显影响（RSD＜2.0%）。

2.6.3 柱温 取“2.1.2” 项下对照品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，考察不同柱温25、30、35℃对相对校正因子的影响，结果见表5，可知均无明显影响（RSD＜2.0%）。

2.7 色谱峰定位 以延胡索乙素（内标） 为基准峰，测定在“2.2.1” 项仪器、色谱柱下各成分相对保留时间，结果见表6，可知均无明显影响（RSD＜2.0%）。

表4 不同体积流量对相对校正因子的影响Tab.4 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

表5 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

表6 各成分相对保留时间Tab.6 Relative retention time of various constituents

2.8 样品含有量测定 取3 批丸剂，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，分别采用外标法、一测多评法计算含有量，结果见表7，可知2 种方法所得结果无明显差异（RSD＜2.0%）。

表7 各成分含有量测定结果（mg／g， n＝3）Tab.7 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝3）

3 讨论

朴沉化郁丸中香附具有疏肝解郁、理气止痛的功效，厚朴燥湿行气、宽中除满，合为君药；陈皮、枳壳、木香、檀香理气和胃、调中止痛，沉香、柴胡、青皮疏肝解郁、降逆止呕，合为臣药；延胡索、片姜黄、莪术活血祛瘀、行气止痛，丁香、高良姜、肉桂温中散寒止痛，豆蔻、砂仁化湿行气、温中止呕，合为佐药；甘草调和诸药，为使药，诸药合用，共奏疏肝解郁、开胃消食之功。参考中药质量标志物确定原则［11-12］，以君药为主，兼顾臣、佐、使药，本实验选取朴沉化郁丸中君药香附所含α-香附酮，臣药陈皮、枳壳、青皮所含柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮，佐药延胡索所含延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱、四氢小檗碱作为指标成分，采用一测多评法，以延胡索乙素为内标，建立与其他成分之间的相对校正因子，并通过耐用性考察、色谱峰定位、外标法测定结果对比，发现该方法操作简便，稳定性好，可用于该制剂质量评价和控制。