魏慧玲，王海山，杨伟娜

(1.济南市济钢医院皮肤科，山东 济南 250101；2.山东中医药大学第二附属医院生殖科，山东 济南 250101)

硬皮病是一种常见的结缔组织病，其表现为肢体、面部甚至内脏等部位皮肤增厚变性及纤维化，进而出现硬化和萎缩。目前硬皮病发病原因仍不明确，相关研究结果认为该病可能与激素分泌异常、遗传或体液免疫异常等因素有关。炎症因子及Toll样受体(TLR)4/核因子κB(NF-κB)蛋白在胶原纤维的分化、增殖及代谢中扮演重要角色[1-2]。目前，中医药在硬皮病的临床治疗方面具有明显的优势。研究结果显示，当归四逆汤在治疗硬皮病方面取得了良好的效果，但具体机制仍不明确[3-4]。本研究通过注射盐酸博来霉素建立硬皮病模型小鼠，探讨当归四逆汤对硬皮病模型小鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素10(IL-10)及白细胞介素16(IL-16)含量变化及硬皮病皮肤组织TLR4/NF-κB信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

BALB/c小鼠60只，雌雄各半，体重(180±20)g，由济南大学实验动物中心提供，动物合格证号为SYXK(鲁)2018-0001，实验室普通清洁环境饲养，适应性喂养1周后开始实验造模。本研究经济南大学动物实验伦理委员会批准。

1.2 仪器

高速离心机(德国Sigma公司)；恒温孵育箱(上海福玛公司)；抗敏脱毛机(广州有喜公司)；光学显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.3 药品与试剂

当归四逆汤(济南市济钢医院中药房，免煎颗粒)置于凉水中浸泡1 h，蒸煮30 min后浓缩至质量浓度为2 g/ml。醋酸泼尼松龙片(哈药集团有限公司，批准文号：国药准字H23020185)。盐酸博来霉素(瀚晖制药有限公司，批准文号为国药准字H20055883，规格为1.5万U)。兔抗小鼠TLR抗体(批号：11002)、兔抗小鼠NF-κB抗体(批号：4400)均购自上海万疆生物技术有限公司；BCA蛋白测定试剂盒(上海荔达生物，批号：20180301)；TNF-α酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(批号：E201901)、IL-10 ELISA试剂盒(批号：P201905)和IL-16 ELISA试剂盒(批号：P201902)均购自北京方程生物有限公司生产。

1.4 方法

1.4.1 分组与造模：将60只BALB/C小鼠以随机数字表法分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组及当归四逆汤治疗组(包括高、中和低剂量组)，每组10只。硬皮病小鼠模型参照文献[5-6]制备，小鼠背部脱毛，400 μg/μl盐酸博来霉素在中央区域采用皮下注射0.1 ml，1日1次，连续4周。空白对照组小鼠注射0.9%氯化钠注射液0.l ml，1日1次，作为对照。

1.4.2 给药：造模后5 d开始给药治疗，当归四逆汤低、中和高剂量组小鼠分别按照剂量4、8和16 g/kg给予当归四逆汤浓缩液灌胃；给予空白对照组、模型对照组小鼠蒸馏水5 ml，灌胃；阳性对照组小鼠给予泼尼松0.2 g/kg灌胃。各组小鼠均1日给药1次，持续3周。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 组织学观察：给药结束24 h后，采用7.5 ml/kg乌拉坦麻醉并处死小鼠，变性处皮肤组织取样2份，一部分组织置于体积分数10%的多聚甲醛中固定，一部分组织置于-80 ℃冰箱中进行保存。将皮肤组织固定后进行石蜡包埋、组织切片，光学显微镜下进行组织病理学观察，采用Image-ProPlus6.0图像处理软件检测各组小鼠真皮和表皮厚度，统计并取平均值。

1.5.2 血清TNF-α、IL-10、IL-16含量测定：小鼠处死后股动脉取血10 ml，置于离心机中，离心半径10 cm，转速3 000 r/min，离心10 min，取上清液，ELISA法检测血清中TNF-α、IL-10及IL-16水平。

1.5.3 蛋白免疫印迹法检测TLR4/NF-κB蛋白表达水平：取出保存的皮肤组织，加入IPA裂解缓冲液，冰上放置30 min，分别提取各组小鼠皮肤组织中的总蛋白，然后使用BCA蛋白测定试剂盒测定各组小鼠皮肤中蛋白质的浓度。蛋白质用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行等量分离，然后移至PDVF膜上，并置于4 ℃下添加一抗与β-肌动蛋白(1∶500)孵育过夜。洗涤后添加辣根过氧化物酶缀合的二抗(1∶500)，室温(25 ℃)下孵育2 h。使用ECL试剂进行显影，采用QuantityOne软件对皮肤组织中蛋白相对表达水平的灰度值进行分析。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠皮肤组织病理学比较

空白对照组小鼠的皮肤无炎症细胞浸润，组织细胞清晰，上皮细胞整齐排列；模型对照组小鼠皮肤厚度均值明显升高，真皮组织细胞排列错乱，毛囊萎缩；经药物治疗后，阳性对照组、当归四逆汤治疗组小鼠上述炎症均得到缓解。与空白对照组相比，模型对照组、阳性对照组及当归四逆汤治疗组小鼠皮肤厚度明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组相比，阳性对照组、当归四逆汤治疗组小鼠皮肤厚度明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，且当归四逆汤的治疗效果具有明显剂量依赖性，见表1。

表1 各组小鼠皮肤组织厚度比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05；与低剂量组比较，△P<0.05；与中剂量组比较，◇P<0.01

Note: vs.the blank control group,*P<0.05; vs.the model control group,#P<0.05; vs.the low-dose group,△P<0.05; vs.the medium-dose group,◇P<0.01

2.2 各组小鼠血清TNF-α、IL-10及IL-16含量比较

与空白对照组相比，模型组小鼠血清TNF-α、IL-10及IL-16含量明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组相比，阳性对照组、当归四逆汤治疗组小鼠血清TNF-α、IL-10及IL-16含量明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，且当归四逆汤的治疗效果具有剂量依赖性，见表2。

表2 各组小鼠血清TNF-α、IL-10及IL-16含量比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05；与低剂量组比较，△P<0.05；与中剂量组比较，◇P<0.01

Note: vs.the blank control group,*P<0.05; vs.the model control group,#P<0.05; vs.the low-dose group,△P<0.05; vs.the medium-dose group,◇P<0.01

2.3 各组小鼠皮肤组织中TLR4、NF-κB信号蛋白表达水平比较

与空白对照组相比，模型对照组皮肤组织中TLR4、NF-κB信号蛋白表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组相比，阳性对照组、当归四逆汤治疗组小鼠皮肤组织中TLR4、NF-κB信号蛋白表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，且当归四逆汤的作用具有剂量依赖性，见表3、图1。

3 讨论

硬皮病发病原因复杂多变，目前多认为其发病与微循环障碍、代谢异常、炎症反应及基因多态性等多因素有关。中医学将硬皮病归于“痹症”“虚劳”范畴，病机多与肺、脾及肾三脏功能失调有关，其本质在肺脾气虚，病理因素包括风邪犯肺、气血凝滞和经络痹阻等，治疗原则当属疏风行水、运脾通肺及活血解毒等[7]。当归四逆汤出自张仲景所著《伤寒论》，方含当归、芍药、通草、桂枝、细辛、甘草和大枣等7味药。该方是养血通脉、温经散寒的首选方，临床常用于治疗血虚寒凝证，如冻疮、血栓闭塞性脉管炎及无脉症等。

表3 各组小鼠皮肤组织中TLR4、NF-κB蛋白表达水平比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与低剂量组比较，△P<0.05；与中剂量组比较，◇P<0.05

Note: vs.the sham-operated group,*P<0.05; vs.the model group,#P<0.05; vs.the low-dose group,△P<0.05; vs.the medium-dose group,◇P<0.05

图1 各组小鼠皮肤组织中TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达

硬皮病的发病机制仍不明确，多数学者认为该病由免疫异常等因素导致成纤维细胞合成并分泌胶原增加，从而引起皮肤和内脏的纤维化所致。TLR作为机体重要的一类蛋白质免疫分子，在机体免疫调控中参与多种免疫应答反应。硬皮病发病后引发机体免疫反应，TLR可以识别并激活机体产生免疫细胞应答，诱导激发抗微生物防御系统，产生趋化因子，通过调节机体辅助性T细胞平衡来抑制成纤维细胞合成并分泌胶原，从而控制疾病病情进展[8-9]。研究结果指出，TLR4/NF-κB信号通路被激活后可介导组织释放TNF-α和IL-16等多种炎症因子[10]；而且TLR蛋白的表达可将多种活化信号传递到细胞内，激活并促进细胞因子的分泌，参与机体免疫反应[11-12]。活化后，TLR4/NF-κB催化IL-10分泌增加并诱导IL-16在组织中分泌增加，提高成纤维细胞生长因子异构体活性，进一步刺激胸腺T淋巴细胞增殖并促进机体免疫反应。研究结果发现，特异性作用TLR炎症反应通路中某个或多个靶点的抗炎药能够显著减少组织细胞功能受损，减轻皮肤病患者的炎症发展[13]。机体发生急慢性炎症反应会导致外周血中白细胞种类和比例发生变化。炎症因子TNF-α、IL-10和IL-16能够调控多种细胞信号通路来控制机体炎症反应情况，促使机体发挥炎症调控作用[14-15]。前期研究结果指出，当归四逆汤对硬皮病有良好的改善和治疗作用，但具体作用机制并不明确[16]。

在正常皮肤组织中，TLR4、NF-κB蛋白低表达或者不表达；当组织出现特异性免疫反应时，TLR4/NF-κB信号蛋白表达即出现明显升高。本研究建立硬皮病模型小鼠，采用当归四逆汤进行干预治疗，探讨硬皮病模型小鼠体内炎症因子及TLR4/NF-κB信号通路蛋白的变化，验证当归四逆汤治疗硬皮病的作用机制。本研究结果显示，造模后小鼠的血清TNF-α、IL-10和IL-16含量均明显高于未造模组。用药治疗后，阳性对照组、当归四逆汤治疗组小鼠血清TNF-α、IL-10和IL-16含量出现降低，其他组无明显变化，说明当归四逆汤可能通过发挥抗炎作用，调控了硬皮病小鼠机体免疫应答。本研究结果发现，造模后小鼠皮肤组织中TLR4、NF-κB蛋白表达水平出现明显升高，说明TLR4/NF-κB信号通路介导的皮肤炎症信号增强，也进一步说明TLR4/NF-κB信号通路及其免疫机制与硬皮病的发病具有一定联系。当归四逆汤治疗组小鼠皮肤组织TLR4、NF-κB表达水平出现下降，说明当归四逆汤可有效降低硬皮病模型小鼠皮肤组织TLR4、NF-κB的表达，并调节TLR4/NF-κB信号通路中负反馈蛋白的表达，有效控制炎症信号通路的传导，进而控制免疫应答。同时，当归四逆汤高剂量对硬皮病模型小鼠的症状改善情况更为显著，说明当归四逆汤治疗硬皮病小鼠具有剂量依赖性。因此，TLR4/NF-κB影响疾病发生发展的过程可能与靶向调控炎症因子表达有关，提示临床治疗硬皮病可以从TLR4/NF-κB信号通路寻找新思路。