马杨君，崔 凯，邹 琦，李和平*

（1.东北林业大学 野生动物与自然保护地学院，哈尔滨 150040；2.青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109）

1951年，美籍华人张明觉（Chang M C）［1］和澳大利亚科学家C.R.Austin［2］几乎同时发现，哺乳动物精子必须在雌性生殖道内经历一段成熟过程才能获得受精能力。1952年，C.R.Austin将这一现象称之为精子获能（capacitation）。精子获能现象的发现被认为是体外受精史上的一个里程碑。精子在受精前必须获能，这是哺乳动物独具的特性。因此精子体外诱导获能是体外受精研究中必须首先解决的问题之一。

亚牛磺酸是具有广泛生理活性的物质。L.E.Cornett等［3］和R.L.Mrsny等［4］最早发现，金黄地鼠精子在体外培养基中会很快死亡，但加入亚牛磺酸后情况获得改善，存活时间显著延长，为精子的体外获能与受精创造了条件。

鹿是重要的经济动物，开展其受精生物学研究同样具有重要科学意义，但目前有关亚牛磺酸对其精子体外获能的研究很少。本研究以马鹿为试验对象，开展了亚牛磺酸对鹿精子体外获能影响的研究，以期为亚牛磺酸在鹿体外受精实践中提供基础的数据参考。

1 材料方法

1.1 精液来源

马鹿新鲜精液，以人工采精的方法采自同一头成年健康种公鹿。采得的新鲜精液用稀释液稀释后，于0.25 mL细管中分装，0～4℃保存（不超过5 d）。

1.2 试剂

Hypotaurine、BSA、肝素、Penicillin G、Streptomycin sulfate、NaCl、KCl、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、Na2HPO4·7H2O、NaH2PO4、Na-Pyruvate、NaHCO3、Glucose、台盼蓝，均购自SIGMA公司；DMSO，AMRESCO 分装；Phenol Red，购自ALDRICH公司；俾士麦棕Y，购自CHROMA公司；玫瑰红B、戊二醛、乙醇，均为国产分析纯。

1.3 精子体外获能培养液

BO／TALP基础液按照细胞培养用液的要求配制。洗精液为BO／TALP基础液+6 mg／mL BSA，获能液为BO／TALP基础液+6 mg／mL BSA +10μg／mL肝素。溶液均在使用前配制，0.22μm滤器过滤除菌后，于CO2培养箱中平衡4 h以上使用。各种培养液均采用灭菌超纯水配制。

1.4 试验方案

采用上浮法，在获能液BO／TALP基础液+6 mg／mL BSA +10μg／mL肝素中，分别添加亚牛磺酸至终浓度为0，30，50，70，100，200μmol／L的浓度梯度，处理45 min，观测体外获能效果；并随之制作培养滴，在培养箱中培养，于2，4，6，8 h后镜检，记录精子活率，计算弯尾率。

2 结果

2.1 BO液中亚牛磺酸对精子获能的影响

见表1。

表1 BO液中不同浓度亚牛磺酸对马鹿精子体外获能的影响

在BO液中使用不同浓度亚牛磺酸，随着亚牛磺酸浓度的增加，精子活力、弯尾率逐渐提高。各添加组精子活力、弯尾率均显著高于不添加组（P＜0.05）。亚牛磺酸浓度为200μmol／L的添加组精子活力最高，但与亚牛磺酸浓度为100μmol／L的添加组差异不显著（P＞0.05），即亚牛磺酸浓度为100，200μmol／L的两个添加组精子活力相当。亚牛磺酸浓度为100μmol／L的添加组精子弯尾率最高，显著高于其他添加组（P＜0.05）。

2.2 TALP液中亚牛磺酸对精子获能的影响

见表2。

表2 TALP液中不同浓度亚牛磺酸对马鹿精子体外获能的影响

在TALP液中使用不同浓度亚牛磺酸，各添加组精子活力、弯尾率均显著高于不添加组（P＜0.05）。亚牛磺酸浓度为200μmol／L的添加组精子活力最高，但与亚牛磺酸浓度为70μmol／L、100μmol／L的两组差异不显著（P＞0.05），即亚牛磺酸浓度为70，100，200μmol／L的三组精子活力相当。亚牛磺酸浓度为100μmol／L的添加组精子弯尾率最高，显著高于其他组（P＜0.05）。

2.3 时间与亚牛磺酸对精子活率的影响

2.3.1 BO液中亚牛磺酸对精子活率的影响 见表3。

在BO液中添加不同浓度亚牛磺酸可改善精子活率，2～8 h期间精子活率均高于不添组，即添加亚牛磺酸可缩减精子活率的降低、延缓精子活率的降低速度。

2.3.2 TALP液中亚牛磺酸对精子活率的影响 见表4。

表4 TALP液中亚牛磺酸对精子活率的影响

在TALP液中添加不同浓度亚牛磺酸对精子活率的影响效果、趋势与在BO液中的效果相似，但亚牛磺酸在TALP液中的效果总体优于在BO液中的效果。

3 讨论

精子获能是所有哺乳动物精子受精前必须经历的一个生理阶段［2］。早期人们采用精子体内获能的方法，从交配母兽的子宫中冲取获能精子，再与卵子在体外实现受精［5］。但是体内获能常常受到很多条件的限制，为此亟待发展一种体外获能的方法。于是研究者便使用各种动物的体液（如输卵管液、滤泡液和血清）使精子在体外获能［6］，但这些体液成分相当复杂，很难确定何种成分参与诱发或支持精子获能。1971年Y.Toyoda等［7］最先采用了一种特定的活性培养基使精子获能并成功完成体外受精，自此分析体外精子获能成为比较容易的事情。体外获能技术可以较好地控制试验条件，并可逐个分析获能相关因子。目前使用的体外受精培养基和体外获能培养基是在台式液、Kerb-Ringer氏液和BO液基础上添加适当的能量物质，如葡萄糖、乳酸盐、丙酮酸盐和白蛋白等改良而来的，并用获能诱导因子来诱导获能和顶体反应［8］。常用的获能诱导因子有肝素、BSA、卵泡液、A23187等。

鹿精子体外获能的研究还处在起步阶段，现已有的研究表明以TALP、BO、HIS和mKRB为基础液均可使马鹿精子获能，肝素和咖啡因等能有效促进马鹿精子获能并完成体外受精［9］。

亚牛磺酸作为诱导精子获能的诱导因子，在其他动物如鼠、牛等已有研究报道，并已经证明亚牛磺酸是具有广泛生理活性的物质［3-5］，而且研究也证实，在获能液中同时添加亚牛磺酸可显著提高精子活率［10-11］。

为了探讨亚牛磺酸对马鹿精子体外获能的诱导作用，本试验采用上浮法，以获能液BO／TALP基础液+6 mg／mL BSA +10μg／mL肝素中，分别添加亚牛磺酸至终浓度为0，30，50，70，100，200μmol／L浓度梯度的试验设计，观测了精子活力、弯尾率、精子活率，以此评价亚牛磺酸对马鹿精子体外获能的影响。取得的试验结果为后续开展马鹿体外受精等受精生物学研究提供了数据参考。