王 皓，郑 鹏，王 雪，Adegoke E O，黄富硕，马铭钧，张贵学

（东北农业大学 动物科技学院，哈尔滨 150030）

防御素（Defensins）是一类不含糖链的碱性阳离子多肽，广泛分布于动植物界，富含6个半胱氨酸结构和3对分子内二硫键［1-5］。防御素具有多方面的免疫功能，对细菌、病毒和部分寄生虫都有灭杀作用，不但是先天性免疫组成部分还参与适应性免疫［6］。人类表达α-防御素和β-防御素［7］。现已发现人类α-防御素6种；β-防御素31种［8］，其中6种（HBD1-6）已经被证明［9-11］。人类防御素主要表达于与外界相接触或相通的各种黏膜细胞，例如呼吸道、胃肠道、泌尿道、生殖道以及皮肤等［10］。研究表明，防御素水平经常在感染炎症或组织损伤的反应中发生改变［3，12］，表明防御素在免疫调节作用中发挥作用。

双抗具有杀菌作用，可以直接添加到细胞培养液内，具有抑制细菌生长、避免细胞污染的作用。同时抗生素也是一种细胞毒素，其是否会直接作用于有机体组织细胞，导致天然防御应答鲜见报道。故本试验意在通过青霉素和链霉素两种抗生素处理Hela细胞，探究抗生素对子宫颈上皮细胞DEFA1和DEFB1表达的影响，为抗生素刺激细胞的天然防御提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

Hela细胞株，ATCC编号CCL-2；DMEM高糖培养基，美国Gibco公司产品；胎牛血清（FBS），美国ScienCell公司产品；PBS和胰蛋白酶，均为Solarbo公司产品；DMSO，购自美国Sigma公司；青霉素钠和硫酸链霉素，购自碧云天生物技术公司；孕烯二酮（孕酮）和17-β雌二醇，购自Sigma公司；Trizol，美国Ambion公司产品；反转录试剂盒，加拿大Abm公司产品；PCR试剂盒，TakaRa公司产品；电泳所用TAE，纳川生物技术公司产品；琼脂糖为Biowest公司产品；引物，由吉林库美生物科技公司合成；荧光定量试剂盒FastStart Universal SYBR Green Master（ROX），Roche公司产品；RIPA裂解液，Thermo Fisher公司产品；SDS-PAGE电泳液，Solarbo 公 司 产 品；1.5 mol／L Tris- HCl（pH＝8.8），Solarbo公司产品；配制TBST所用1.0 mol／L Tris-HCl（pH＝8.0），Solarbo公司产品；1.0 mol／L Tris-HCl（pH＝6.8），Solarbo公司产品；四甲基乙二胺（TEMED），Biosharp公司产品；抗体，购自Proteintech公司；ECL发光试剂盒，南京诺维赞生物科技有限公司产品；膜再生液，购自Solarbo公司。

1.2 双抗母液配制

按照青霉素（P）10 kU／mL+链霉素（S）10 mg／mL配制青霉素-链霉素混合溶液（PS），用0.22μm滤器过滤除菌，将配好的双抗母液分装至小瓶后-20℃保存，备用。后面试验中1%双抗即为100 U／mL青霉素+0.1 mg／mL链霉素的青链霉素混合液，5%双抗同理。

1.3 细胞培养

采用含有10%血清、1%双抗的DMEM高糖培养液，在37℃、5%CO2培养箱中恒温恒湿培养Hela细胞。细胞生长至80% ～90%汇合度时，用0.25%胰蛋白酶消化传代继续培养，以供后续试验使用。

1.4 细胞处理

1.4.1 不同浓度的双抗培养Hela细胞 将生长状况良好的Hela细胞按照1×106个／孔接种到六孔板中，待Hela细胞贴壁后分别用含无双抗、1%双抗和5%双抗的培养液（FBS浓度为10%）培养处理Hela细胞。48 h后，用荧光定量PCR检测DEFA1和DEFB1的表达。

用Western Bolt测定DEFA1蛋白的表达情况。收集细胞加入RIPA裂解液裂解细胞，离心，提取蛋白上清液，加入loading buffer，100℃煮样5 min，上样，电泳，分离，转膜至含50 g／L脱脂奶粉的TBST，室温封闭滤膜1 h，一抗β-actin（1∶4 000），DEFA1（1∶150）4℃孵育过夜。在摇摆式摇床上用TBST清洗PVDF膜3次后，室温孵育二抗2 h（1∶3 000），TBST清洗膜3次，ECL化学发光法显影成像，使用Image J对蛋白条带进行灰度分析。

1.4.2 无双抗培养Hela细胞后不同时间DEFA1和DEFB1表达的影响 由于Hela细胞长期在双抗培养和保存环境中，故从相反的角度确定双抗对DEFA1和DEFB1表达的影响。将生长状况良好的Hela细胞按照1×106个／孔接种到六孔板中，待Hela细胞贴壁后用不含双抗的培养液培养。分别在24 h、48 h、72 h后收细胞。用荧光定量PCR检测DEFA1和DEFB1的表达，Western Bolt测定DEFA1蛋白的表达情况，方法同1.4.1。

1.4.3 双抗对Hela细胞DEFA1和DEFB1表达的影响 将生长状况良好的Hela细胞按照1×106个／孔接种到六孔板中，待Hela细胞贴壁后分别用含无双抗、1%青霉素、1%链霉素的培养液分别培养。48 h后收细胞，用荧光定量PCR检测DEFA1和DEFB1的表达，Western Bolt测定DEFA1蛋白的表达情况，方法同1.4.1。

1.5 引物设计

根据GeneBank中人β-actin基因（登录号为X00351.1）防御素alpha1（DEFA1）和防御素beta1（DEFB1，登录号为NM_004084.3，NM_005218.3），用Primer 5.0软件分别设计特异性引物。其中β-actin为内参基因，引物序列见表1。引物由吉林库美生物科技有限公司合成。

表1 引物序列

1.6 统计分析

ΔCt＝目的基因的Ct值-内参基因的Ct值。

ΔΔCt＝（试验组目的基因Ct值-试验组内参基因Ct值）-（对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值）。

目的基因相对表达量＝2-ΔΔCt。

2 结果

2.1 Hela细胞镜下观察

无双抗培养24，48，72 h后，用倒置显微镜放大100倍后观察结果见图1。

2.2 双抗对Hela细胞防御素的影响

2.2.1 双抗对DEFA1的影响 见图2、图3。QPCR结果表明，1%、5%双抗处理组与对照组相比，Hela细胞的DEFA1表达差异显著（P＜0.05）。Western结果表明，与定量检测结果相符合。

2.2.2 双抗对DEFB1的影响 见图4。从qPCR结果可以看出，随着青霉素、链霉素混合液浓度的增加，DEFB1基因表达量逐渐升高，浓度为5%时DEFB1表达量最高，三组之间均差异显著（P＜0.05）。说明微生物毒素对防御素的表达有促进作用。

2.3 无双抗培养Hela细胞不同时间Hela细胞防御素的变化

2.3.1 无双抗培养不同时间对DEFA1的影响 见图5、图6。qPCR结果表明，无双抗培养细胞时随着培养时间的延长，DEFA1基因表达量逐渐降低，在培养24 h、48 h和72 h之间差异显著（P＜0.05）。

蛋白结果表明，无双抗培养细胞时到72 h时，DEFA1的蛋白表达量基本不变，与定量结果不一致。

2.3.2 无双抗培养不同时间对DEFB1的影响 见图7。qPCR结果表明，无双抗培养细胞时，DEFB1基因表达量在培养24 h和48 h时无差异，72 h和前两组差异显著（P＜0.05）。

2.4 单独加入青霉素和链霉素培养Hela细胞

2.4.1 青霉素和链霉素对DEFA1的影响 见图8、图9。qPCR结果显示，使用1%青霉素和1%链霉素分别处理Hela细胞，DEFA1基因表达量均显著高于对照组（P＜0.05），1%青霉素处理组的DEFA1表达量高于1%链霉素处理组。蛋白表达结果表明，1%青霉素处理组和1%链霉素处理组DEFA1蛋白表达量均高于对照组。

2.4.2 青霉素和链霉素对DEFB1的影响 见图10。qPCR结果显示，1%青霉素和链霉素处理组的DEFB1基因表达显著均高于对照组（P＜0.05）。说明青霉素和链霉素均能促进防御素DEFB1的表达。

3 讨论

青霉素是一种真菌毒素，苏格兰科学家亚历山大弗莱明在1928年发现了青霉素［13］，1942年被人们利用来治疗感染［14］。链霉素是1943年被赛尔曼在灰色链霉菌的提取物中发现的一种细菌毒素［15］，对某些微生物，如结核杆菌有特效，是继青霉素之后第二个被大量生产并广泛应用的抗生素。

3.1 青霉素和链霉素单独处理对防御素的影响

从图8～10的结果可知，青霉素和链霉素均能促进两种防御素（DEFA1和DEFB1）的表达，在青霉素或链霉素的作用下先天性免疫机制被触发［6］，产生防御素，防御素作为生殖道的第一道天然防御屏障发挥多种作用［6］。

3.2 双抗对防御素的影响

图2～4的结果表明，随着双抗浓度的增加，DEFA1和DEFB1表达量均显著升高。由此可见，作为微生物的毒素可以激发天然防御机能。面对外源病菌刺激时，子宫颈上皮细胞通过产生防御素［6］防御外源刺激，且随着刺激强度的增加子宫颈上皮细胞防御素的分泌也会增加。

3.3 无双抗培养不同时间Hela细胞防御素的变化

图5、图7的结果表明，随着抗生素刺激的消失，在mRNA水平DEFA1和DEFB1表达量下降，即转录停止，而图6的蛋白结果显示，在抗生素刺激消失的72 h内DEFA1蛋白水平表达量不变，即翻译还在继续。这表明在抗生素刺激消失一段时间之内，子宫颈上皮细胞防御素不会立即消失，仍然有防御能力。细胞培养时加入的双抗为青霉素和链霉素按照一定比例的混合液。综合以上结果，细胞培养中加入双抗防止污染，双抗的作用除了青霉素和链霉素二种抗生素本身的直接杀菌作用外，还能刺激细胞产生防御素。

4 结论

青霉素和链霉素除了有直接杀菌作用外，双抗可促进子宫颈细胞天然防御反应，刺激细胞产生防御素间接杀菌。