崔晴晴 邢朝品 林新梅 张新顺 段培锋 李高峰

1 滨州医学院附属医院儿童消化与肾病科 山东 滨州 256603；2 滨州医学院附属医院超声医学科

大多数的研究表明急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是炎症风暴引起的，炎症风暴的发生是多种效应细胞释放的炎症介质导致的，中性粒细胞浸润是发病的关键环节[1-2]。 近年来大量的研究表明骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)能通过抑制T淋巴细胞的激活和增殖，改变细胞因子的效应模式[3]。MSCs广泛应用于多种疾病的治疗，包括自身免疫性疾病和炎症[4]。本研究主要采用人胎盘间充质干细胞(human placenta mesenchymal stem cell, hPMSCs)静脉注射的方法，观察其对肺损伤时炎症因子调节变化情况，为ALI提供一种新的治疗方法。

1 材料与方法

1.1 材料 健康清洁级SD大鼠36只，体质量220～260 g；油酸(山东莱阳经济技术开发区精细化工)；地塞米松磷酸钠注射液(山东鲁抗药业)；胎牛血清、DMEM培养基(Hyclone，美国)，胰酶、IV胶原酶(sigma)；大鼠IL-8ELISA试剂盒，大鼠IL-10 ELISA试剂盒(R&D公司，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 hPMSCs的分离培养 选取人足月妊娠产妇的胎盘，剪取新鲜胎盘蜕膜层与羊膜层之间的绒毛组织，用含双抗的PBS反复冲洗。将绒毛组织剪至细小糊状，加入含胰蛋白酶、胶原酶Ⅳ的 L-DMEM，于37℃恒温摇床内消化30 min后用200目无菌金属滤网过滤，用PBS冲洗过滤后的细胞悬液2次，离心10 min弃上清，加入培养液置于培养箱内培养，每3～4 d全量换液一次，按常规方法传代细胞。

1.2.2 实验动物分组模型制备 健康雄性清洁级SD大鼠，平均体质量220～260 g，将36只大鼠随机分为3组(n=12)：对照组，舌下静脉注射生理盐水；肺损伤组，舌下静脉注射油酸(0.2 mL/kg)；移植组，舌下静脉注射油酸，然后立即经另一侧舌下静脉注入培养第4代hPMSCs。造模成功24 h后采用10%水合氯醛麻醉各组大鼠，成功后取样检测。

1.2.3 指标的检测 所有动物均在治疗24 h后处死，采取腹主动脉分离血清置于-70℃冰组箱保存待检。左下肺称重后，70℃烘箱放72 h后再次称质量后计算肺组织湿干比；取左上叶肺组织用于病理组织检查；右肺中叶用10 mL生理盐水灌洗3次，收集灌洗液5 mL，800 r/min离心5 min，进行染色计算中性粒细胞比例。分离右肺上叶制备匀浆被检。

1.2.4 主要观察指标 肺组织病理形态观察，肺组织的湿干质量比(W/D)测定；肺泡灌洗液中中性粒细胞比例；病理组织检查；ELISA 法检测血清中及肺组织中IL-8、IL-10的含量。

2 结果

2.1 肺组织HE染色光镜观察各组肺组织结果 光镜下观察各组肺组织结果见图1。对照组肺泡结构完整，肺泡腔内可见少量巨噬细胞，管壁无明显增厚；肺损伤组肺泡结构杂乱无章，完整性遭到破坏，腔内大量渗出液和中性粒细胞浸润，肺泡间隔明显增宽；移植组肺泡结构完整性欠佳，肺泡腔有中性粒细胞浸润，肺泡壁变厚，肺泡间隔增宽，损伤程度较损伤组减轻。肺组织病理学观察，正常组肺泡组织构正常，肺损伤组肺组织出现典型的ALI改变，细胞移植组损伤程度较轻。

图1 肺组织病理图像(HE染色，×400)

2.2 肺组织W/D测定及中性粒细胞计数比例 与对照组比较，肺损伤组和移植组支气管肺泡灌洗液中性粒细胞数目明显升高(P<0.05或<0.01)，肺损伤组和移植组支气管肺泡灌洗液W/D比也升高(P<0.05)。与肺损伤组比较，移植组支气管肺泡灌洗液中性粒细胞数目、W/D比均降低(P<0.05)，见表1。

组别中性粒细胞数肺组织湿/干比对照组5.08±7.534.20±0.59损伤组55.78±12.53∗∗5.75±0.52∗移植组30.36±12.53∗∗#4.75±0.62∗#

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与损伤组比较，#P<0.05。

2.3 各组肺组织及血浆中IL-8的表达水平 与对照组比较，肺损伤组和移植组血浆及肺组织IL-8水平明显升高(P<0.05或<0.01)；与肺损伤组比较，移植组IL-8的水平明显降低(P<0.05或<0.01)，见表2。

表2 各组肺组织及血浆中IL-8表达水平 单位：pg·mL-1

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与损伤组比较，#P<0.05，##P<0.01。

2.4 各组肺组织及血浆中IL-10的表达水平 与对照组比较，肺损伤组和移植组血浆及肺组织IL-10的水平明显升高(P<0.05或<0.01)；与肺损伤组比较，移植组IL-10的表达水平显著升高(P<0.05或<0.01)，见表3。

表3 各组肺组织及血浆中IL-10表达水平 单位：pg·mL-1

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与损伤组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3 讨论

研究表明，ALI病理生理机制主要包括炎症反应和氧化应激两个方面[5]。医学的研究及临床工作对于该病的治疗多采用对症支持治疗，同时也尝试各种不同的治疗方法，但是该病的死亡率在目前的医疗水平下仍居高不下[6-7]。其主要病理特点是肺上皮细胞和内皮细胞屏障广泛性受损，肺毛细血管弥漫性损伤、通透性增强，中性粒细胞涌入肺组织，发生强烈的炎症因子风暴，导致多脏器功能损伤从而导致死亡[8]。油酸损伤肺组织可造成毛细血管通透性改变，肺组织病理切片观察炎症早期产生大量的炎症细胞，损伤内皮细胞，在各种因素的作用下导致炎症因子的迁移和浸润，造成肺泡间隔增宽。本研究制备的油酸ALI模型通过临床表现及病理切片发现存在上述症状。因此，本研究采用油酸损伤是可以成功复制ALI模型的。ALI发病的实质是炎症反应综合征，其包含强烈的炎症反应和免疫调节反应，因此降低炎症反应，改善免疫失衡是改善其预后的一个治疗靶点[9]。

目前国内外研究证实与ALI发生发展密切相关的是促炎因子和抗炎因子的失衡[10]。炎症因子大量释放造成炎症风暴是ALI最常见的病理表现[11]。IL-8是重要的促炎因子和炎症趋化因子，它是能够促进中性粒细胞激活，触发中性粒细胞脱颗粒，表面黏附分子的表达及活性氧分子产物释放，综上所说该因子在中性粒细胞激活和迁移中发挥决定性作用[12]。IL-10是一种重要的抗炎因子和免疫抑制剂，它可以通过多种机制下调炎性反应，促进免疫平衡。研究表明hPMSCs可通过抑制损伤组织的免疫反应减轻细胞自噬，从而缓解肺水肿和炎症反应[13]。

本实验的研究结果表明经hPMSCs治疗后肺损伤的程度减轻，且可以降低致炎因子IL-8的表达，升高抗炎因子IL-10的表达，因此我们推测hPMSCs能够抑制损伤组织的免疫反应减轻炎症细胞的聚集，从而减弱炎症风暴的强度或者避免严正风暴的发生，但该过程是通过何种通路来调节炎症因子的平衡的，仍需要我们进一步的研究。