潘璐 邹旭 张往祥 彭冶

(南方现代林业协同创新中心(南京林业大学)，南京，210037) (南京林业大学)

土地盐渍化是当今世界性的资源问题和生态问题，越来越严重地威胁到农作物与观赏植物正常的生命活动[1]。我国盐碱地面积有3 400×104hm2[2]，约占可用耕地面积的25%，广泛分布于“三北地区”和沿海地区[3]。苹果(MaluspumilaMill.)的耐盐性中等，它的耐盐能力主要取决于砧木。因此，选择耐盐能力强的砧木是提高苹果耐盐性的关键[4]。前人对苹果砧木已经进行了一系列耐盐能力的测定，筛选出了美国黄海棠(AmericamalusSpectabil.)、珠美海棠(Maluszumi(Matsum) Reder.)、小金海棠(MalusxiaojinensisCheng et Jiang.)和八棱海棠(MalusrobusstaRehd.)等具有一定耐盐性，观赏价值的品种[5-8]。而山荆子(Malusbaccata(L.) Borkh.)和湖北海棠(Malushupehensis(Pamp.) Rehd.)为我国本土植物，山荆子主要分布于中国的东北、华北及西南地区，湖北海棠分布于我国黄河流域以南大部分省区。两种海棠花果美丽、树形优雅，是苹果属重要的种质资源，但对山荆子和湖北海棠耐盐能力及两者间的耐盐性比较鲜有报道。

本试验通过人工模拟盐胁迫，对盐胁迫下山荆子和湖北海棠幼苗叶片生长、叶色和生理生化指标进行了研究。探讨并对比山荆子和湖北海棠的耐盐性与适应机制，以期为生产上苹果苗木砧木的选择提供理论依据，也为丰富盐碱地区的园林植物资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试材与取样

供试植株为湖北海棠和山荆子1年生实生苗，由扬州小苹果有限公司提供。2018年3月中旬将材料定植于口径20 cm、高28 cm的无纺布盆中，每盆两棵，盆中基质为当地田间V(黄土)∶V(林下泥炭土)∶V(珍珠岩)=4∶1∶1。将盆置于30 cm口径的托盘上，给与正常的水分管理，使植株恢复稳定生长。

供试植株移入温室大棚后，采用随机区组试验设计，每区组4个盐浓度处理，共两个区组，每区组每种盐各处理40株苗木，共计320株苗木。按照0、0.1%、0.3%、0.5%的盐质量分数梯度排列。参考前人的研究方法[9]，有一定改动，经计算分别加入盐的量为0 g，0.1% 161.36 g，0.3% 484.08 g，0.5% 806.8 g。为防止一次性加入盐溶液质量分数过高植物出现烧苗现象，将各处理组NaCl总质量平均分为4份，连续4 d加入。在加盐前适度控水，用针管将盐溶液缓缓注入土壤里，以保证盐分在土壤中均匀分布。

在胁迫后的第1、7、14、21、28、35天，随机选取3株长势良好的植株，从幼苗顶部往下数第3或4轮成熟叶片。

1.2 指标测定及方法

采用蒽酮比色法测定可溶性糖；丙二醛(MDA)采用硫代巴比绥酸法测定[10]；超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性测定均采用酶联免疫吸附法[11]，所用试剂盒由南京森贝伽生物科技有限公司提供；叶绿素含量的测定采用95%乙醇浸提法[12]。

1.3 数据处理和分析

采用Microsoft Excel 2016进行绘图；用IBM SPSS Statistics 20.0专业软件对数据进行方差分析和Duncan 法显著性检验(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对两种海棠叶片形态的影响

由图1、图2可知，未经NaCl处理的两种海棠在整个试验期间叶色无显著变化，始终保持绿色。经NaCl处理的两种海棠表现出明显的盐害症状，并随着盐浓度的增加和胁迫时间延长盐害症状加剧，表现为叶片失绿、焦枯甚至掉落死亡。

胁迫至21 d时，0.1%盐胁迫下的山荆子叶片表现正常，而0.3%和0.5%盐胁迫下叶片出现枯黄。湖北海棠在胁迫至28 d时，0.3%和0.5%的盐质量分数下的湖北海棠叶片才开始出现枯黄，0.3%盐胁迫枯黄程度较轻微，而0.5%盐胁迫下边缘枯黄严重。胁迫结束时(35 d)，0.1%盐质量分数下山荆子可正常生长；0.5%盐质量分数下山荆子叶片枯黄严重，老叶几乎凋落殆尽，仅保留少数幼叶。这严重影响了植株生长。湖北海棠在0.1%盐质量分数下生长正常，叶片与对照无明显差异；0.3%质量分数下叶片部分枯黄，而0.5%质量分数下叶片大面积枯黄甚至脱落，影响正常生长。

2.2 盐胁迫对两种海棠存活率的影响

植株在盐胁迫下的存活率是植物能否适应盐胁迫环境的直观体现。由表1可看出，盐胁迫35 d后，山荆子和湖北海棠在对照和0.1%盐质量分数下存活率均为100%。表明两种海棠幼苗在0.1%盐质量分数下能正常生长。随着盐质量分数的增加，两种海棠的存活率下降。在0.3%和0.5%质量分数下，山荆子和湖北海棠虽然多数叶片焦枯脱落,但茎干保持了活性，表明两种海棠具有一定的耐盐能力。统计结果表明湖北海棠的存活率大于山荆子，暗示了湖北海棠的耐盐性可能优于山荆子。

表1 盐胁迫下两种海棠的存活率

2.3 盐胁迫对两种海棠叶绿素质量分数的影响

由图3可知，未进行盐胁迫的对照组叶绿素含量相对稳定。在盐胁迫下，两种海棠的叶绿素质量分数随着盐胁迫时间的延长整体呈下降趋势。山荆子在0.1%盐胁迫下，1～14 d有一个缓慢上升的阶段，随后开始缓慢下降，至胁迫结束时含量与胁迫开始较相近但仍低于对照组。而0.3%、0.5%盐胁迫下，叶绿素质量分数一直在减少，胁迫开始的1～7 d缓慢减少，7～35 d期间下降速率较快，35 d时叶绿素含量相比对照组分别减少了42.6%、51.2%。湖北海棠在0.1%下叶绿素质量分数缓慢减少，至35 d时与对照组差异不显著。0.3%、0.5%盐胁迫下，下降得较快，至35 d时叶绿素质量分数较对照组相比分别减少了26.9%、39.6%。胁迫至35 d时，各盐浓度下，湖北海棠叶绿素质量分数分别为山荆子的1.30、1.73、1.69倍，且整个胁迫期间，湖北海棠叶绿素质量分数均比山荆子高，降幅也较小。

2.4 盐胁迫下两种海棠丙二醛(MDA)质量摩尔浓度的变化

由图4可知，未进行盐胁迫(对照)的两种海棠植株MDA质量摩尔浓度相对稳定，而处理组的海棠植株MDA质量摩尔浓度出现了明显变化，随着盐浓度的升高而增加。山荆子在盐胁迫第1 d时，各梯度盐浓度处理与对照组无显著差异(p>0.05)，随着盐胁迫时间的延长MDA质量摩尔浓度逐渐增加，各处理在胁迫35d时达到最大值，分别为对照组的1.28、1.94、2.87倍。湖北海棠在胁迫初期(1～7 d)各处理组与对照组相比差异不显著，随着胁迫时间的延长MDA质量摩尔浓度逐渐增加，各处理在胁迫第35 d时达到最大值，分别为对照组的1.42倍、1.86倍、2.52倍。同时，在0.3%、0.5%下，山荆子MDA质量摩尔浓度分别为湖北海棠的1.10倍、1.20倍。

2.5 盐胁迫下两种海棠可溶性糖质量分数的变化

由图5可知，山荆子和湖北海棠叶片的可溶性糖质量分数对盐胁迫的响应存在差异。山荆子在0.1%盐浓度下，可溶性糖质量分数随胁迫时间的延长而升高，在0.3%、0.5%质量分数下，随胁迫时间的延长，呈现出先升高后降低的趋势，并于21 d达到峰值。湖北海棠在0.1%和0.3%盐处理下，随着胁迫时间的延长，叶片中可溶性糖质量分数随胁迫时间的延长而升高；在0.5%处理下随胁迫时间的延长，呈现出先升高后降低的趋势，在28 d时达到峰值。在相同盐处理下，湖北海棠可溶性糖质量分数达到峰值的时间较山荆子晚，达到峰值时，各盐处理下，湖北海棠可溶性糖质量分数值分别为山荆子的1.18、1.19、1.08倍。

2.6 盐胁迫下两种海棠SOD活性的变化

在整个盐胁迫期间，各个盐处理下的山荆子和湖北海棠SOD活性总体呈现先升高后降低的趋势。在盐处理1～14 d时，山荆子叶片的SOD活性随盐处理的升高而增强，在14～35 d时，随盐处理的升高而呈先升高后降低趋势。在0.1%、0.3%、0.5%盐处理下SOD活性随着盐处理时间的延长，均呈现出先升高后下降的趋势，并分别在第28、21、14天达到峰值，为对照的1.52倍、1.90倍、1.64倍。湖北海棠SOD活性在1～21 d随盐处理的增加呈上升趋势，在第21～35 d时，随着盐浓度的增加，呈先上升后下降趋势。0.1%盐处理下，SOD活性随盐胁迫时间的延长呈逐渐上升趋势，在第35 d达到最大值，为对照的1.69倍；在0.3%、0.5%盐胁迫下，随着胁迫时间的延长SOD活性呈先上升后下降的趋势，并分别在胁迫第28、21 d达到峰值，为对照的2.15倍、1.83倍。在各梯度盐处理下，湖北海棠的峰值达到峰值的时间较山荆子均延后了一星期，且峰值分别为山荆子的1.00 、1.07、1.06倍。

2.7 盐胁迫下两种海棠POD活性的变化

由图7可以看出，在整个盐胁迫过程中山荆子和湖北海棠POD与SOD活性变化趋势基本一致，总体上呈先上升后下降的趋势。山荆子在盐处理第1 d时，各处理组与对照组呈现显著性差异(p<0.05)；第1～14 d，POD活性随着盐浓度的增加呈上升趋势，第14～35 d随盐质量分数的增加呈现出先升高后降低的趋势。0.1%、0.3%、0.5%盐胁迫下POD活性均随着盐胁迫时间的延长呈现出先升高后降低的趋势，并分别在第28、21、14 d达到最大值，为对照组的1.43倍、1.80倍、2.06倍。湖北海棠在盐处理的第1～21 d POD活性随盐处理的增加呈增上升趋势，在第21～35 d随盐处理的增加呈现出先升高后降低的趋势。0.1%盐胁迫下，POD活性随着盐处理时间的延长逐渐升高，胁迫第35 d时达到最大值，为对照组的1.41倍；在0.3%、0.5%盐胁迫下随着盐处理时间的延长，均呈现出先升高后下降的趋势，并分别在第28、21 d达到最大值，为对照的1.66倍、1.79倍。与SOD活性相一致，在各盐处理下，湖北海棠的峰值达到峰值的时间较山荆子均延后了一星期，且峰值分别为山荆子的1.11倍、1.23倍、1.16倍。

2.8 盐胁迫下两种海棠CAT活性的变化

由图7可以看出，在整个盐胁迫过程中山荆子叶片CAT活性总体上呈现出先升高后降低的趋势。在盐处理第1 d时，处理组与对照组无显著性差异(p>0.05)。之后，各盐处理下CAT活性随着盐胁迫时间的延长，先升高后降低，并在胁迫第21 d 达到峰值，分别是对照的1.48倍、1.81倍、1.87倍。而湖北海棠叶片CAT活性，随着盐浓度的升高呈现上升趋势，除0.5%浓度在35 d时下降外，其余盐处理下均随着胁迫时间的延长呈现上升趋势。胁迫35 d时各处理浓度由低到高分别为对照的1.61倍、2.15倍、2.02倍。两种海棠在盐胁迫后期CAT活性显著上升，同一盐处理下湖北海棠比山荆子晚达到峰值，且在0.3%、0.5% 下，湖北海棠CAT活性值分别为山荆子的1.04、1.21倍。

3 结论与讨论

叶片是植物制造有机养料的器官，通过光合作用为其它器官提供所需能量。因此植株受到胁迫时，叶片直接表现出直观的受害症状[13]。叶色是反应植物健康状况和营养状况的敏感指标[14]。叶片的颜色主要由叶绿素、类胡萝卜素和花青素等决定[15]。当叶片叶绿素的质量分数占的比值较大时(60%以上)，叶片呈现绿色；当叶片中花色素苷占的比值较大时(60%～80%)，叶片呈现红色[16]。盐胁迫下，植物叶片内的叶绿体会遭到破坏，抑制叶绿素的合成或者促进叶绿素的降解[17]，从而影响了叶片色素的成分和比例。山荆子和湖北海棠叶片在盐处理质量分数0、0.1%下，植株叶片均成绿色，并未表现出盐害症状。叶绿素质量分数随着盐胁迫时间延长和盐质量分数的增加呈下降趋势。而整个胁迫过程中，湖北海棠叶绿素较山荆子相比，总量更高且下降速率和量较缓慢。

在0.3%、0.5%盐质量分数下，山荆子在胁迫21 d时开始出现黄化，叶片边缘卷曲焦枯。同时，在21 d时山荆子叶绿素开始急剧下降，0.5%胁迫下下降速率更快，表明叶绿素质量分数的减少对叶色变化有直接影响。湖北海棠叶片则胁迫28 d后才开始出现盐害症状，盐害程度较山荆子而言较轻，相应地，湖北海棠叶绿素质量分数也是从28 d后开始出现明显下降的趋势。两种海棠叶片焦枯失绿，可能是因为盐胁迫会使植株水分亏缺，破坏了细胞的膜系统，损害了叶绿体功能，进一步影响叶绿素合成，也促进了叶绿素酶对叶绿素的分解，导致叶绿素质量分数降低，使得细胞内色素质量分数的比值发生变化。与孙方行等对海棠(Malusspectabil)、石榴(Punicagranatum)和桃树(Amygdaluspersic)的研究结果相一致[18]。

植物在盐胁迫下的成活率是直接反应植物能否适应盐环境的指标之一。本试验中，在盐质量分数为0、0.1%下山荆子和湖北海棠的存活率均为100%；随着盐质量分数的升高植株的存活率降低。在0.5%盐质量分数下山荆子和湖北海棠的成活率分别为72%和81.33%。杨文翔等人的研究表明山荆子抗盐性耐盐性差[19]，而本试验结束后，0.5%盐质量分数下山荆子大部分植株只是叶片脱落而茎干未死亡，存活率仍达到了72%。可能是本次试验条件的限制，胁迫天数较短的原因，使得山荆子存活率较高。

植物在遭受逆境胁迫过程中，由于自由基的产生与清除的动态平衡关系被破坏，致使活性氧积累，引发并加重膜脂过氧化作用，造成丙二醛(MDA)大量增加，使细胞膜系统受到破坏[20]。因此MDA变化可以作为衡量植物在盐胁迫下受伤害程度大小。实验结果表明，整个胁迫过程中山荆子和湖北海棠幼苗叶片内的MDA质量摩尔浓度均随着盐浓度的增加而增加。说明胁迫初期可能是植物在短时间内能通过自身的防御系统保护细胞免受损害。随着时间的延长，活性氧产生速率的增加，细胞膜系统损伤严重，超过自身调节能力，膜脂过氧化作用加剧，造成MDA大量积累，积累的MDA与膜蛋白结合引起蛋白质分子内和分子间交联，蛋白质分子发生聚合，引起膜结构和功能的破坏，使质膜透性增大，细胞内溶物大量外渗，从而影响海棠叶片的生理代谢功能，使幼苗叶片出现变黄，卷枯，衰老死亡，甚至使整个植株受害加重[21]。而且湖北海棠MDA的增幅均小于山荆子，表明山荆子膜系统受损程度较湖北海棠严重。由此推测，盐胁迫下活性氧的大量积累是伤害的重要两种海棠叶片受盐害的原因之一。

在盐渍化土壤中，植物同时遭受渗透胁迫。渗透胁迫诱导产生的有机渗透调节是非盐生植物对胁迫的一种生理响应机制[27]。可溶性糖、甜菜碱、脯氨酸、可溶性蛋白和多元醇等是重要的渗透调节物质[28]。植物可通过积累渗透调节物质来维持体内渗透水分平衡、稳定细胞结构和渗透势，从而保护植物减少或免受胁迫伤害[29]。本试验结果显示，山荆子和湖北海棠随着盐质量分数的增加和胁迫时间的延长，叶片可溶性糖质量分数均呈现出先上升后下降的趋势，但在相同盐处理下湖北海棠积累的可溶性糖质量分数比山荆子多。表明在盐胁迫早期两种海棠能够通过增加可溶性糖质量分数来降低渗透势，且湖北海棠的调节能力稍强于山荆子，山荆子对盐胁迫更加敏感。随着盐质量分数的增加和胁迫时间的延长两种海棠的渗透调节能力超过一定的阈值而降低，同时盐胁迫后期净光合速率的降低使糖合成量减少，导致可溶性糖质量分数降低。本研究与新疆野苹果(Malussieversii(Ledeb.) Roem.)[30]、桑树(Morusalba)[31]等研究结果一致。本研究结果表明，湖北海棠耐盐性要高于山荆子，山荆子对盐害较敏感，不适宜种植在盐质量分数较高(p>0.5%)的环境中。